弓形虫棒状体颈蛋白5在入侵过程中的生物学功能研究

Toxoplasmosis is a serious zoonotic parasitic disease caused by the protozoan Toxoplasma gondii, which infect humans and almost warm-blooded animals, it not only causes huge economic losses to the livestock production, but also hazard to food safety and human health.The disease has become the focus of attention and at home and abroad, especially study on Toxoplasma gondii pathogenic invasion and immune mechanism is the priority among priorities for research of toxoplasmosis.This project carry out the mechanisms of rhoptry neck protein 5 in Toxoplasma gondii invasion process, based on the application of molecular biology and functional genomics technology. The positive parasites were obtained by transfecting the constructed TgRON5 protein plasmid to T. gondii, and stimulus TgAMA1 protein expression, with which to study the colocalization between TgRON5 protein and TgAMA1 in T. gondii. Analysis of TgRON5 protein expression level in different stages of T. gondii, clarify to the contact between TgRON5 protein and the invasion of T. gondii. By constructing the TgRON5 protein deletion mutant strain and complementary strain, to elucidate the biological function of TgRON5 protein in the process of the invasion of T. gondii. The expected results would not only has important scientific significance, but would also lay the theoretical foundation for the research and development of T. gondii new vaccines and drugs.

弓形虫病是由弓形虫感染人和几乎所有温血动物所引起的一种危害十分严重的人兽共患寄生虫病，给畜牧业生产带来巨大经济损失，同时危及到食品安全和人类生命健康。该病已成为国内外关注的焦点和研究热点，尤其对弓形虫的入侵致病和免疫机制研究是弓形虫病研究的重中之重。本项目应用分子生物学和功能基因组学的技术方法，开展弓形虫棒状体颈蛋白5(TgRON5)在弓形虫入侵过程中的作用机制研究。将TgRON5蛋白基因转入弓形虫中，并刺激TgAMA1蛋白表达，研究TgRON5蛋白与TgAMA1蛋白在弓形虫体的共定位情况，阐明二者在入侵时的关系。解析TgRON5蛋白在弓形虫不同时期的表达水平，阐明TgRON5蛋白与弓形虫入侵之间的联系。通过构建TgRON5蛋白缺失株及互补株，阐明TgRON5蛋白在弓形虫入侵过程中的生物学功能。预期研究结果不仅具有重要科学意义，而且将为弓形虫新型药物和疫苗研制奠定新的理论基础。

弓形虫病是由弓形虫感染人和几乎所有温血动物所引起的一种危害十分严重的人兽共患寄生虫病。入侵是弓形虫首要的致病过程，棒状体是弓形虫极为重要的亚细胞器之一，棒状体蛋白根据在棒状体内的定位分为两类，一是位于棒状体基部的基部蛋白，二是位于棒状体颈部的颈部蛋白，研究证明大部分棒状体蛋白与弓形虫入侵宿主细胞有关。本研究第一部分应用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析，结果显示孢子化卵囊表达水平最高，未孢子化卵囊次之，速殖子较低，缓殖子最低，表明TgRON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究第二部分应用CRISPR/Cas9系统分别成功构建了弓形虫RON5和RON10基因的敲除质粒Cas9-sgRON5和Cas9-sgRON10，电转染，筛选缺失株，进行噬斑实验和小鼠毒力实验；结果显示TgRON5基因是参与弓形虫入侵宿主细胞的关键蛋白，而与逸出无关，TgRON10基因不是弓形虫重要的毒力和致病因子。本研究第三部分分别构建了pVAX-RON5p和pVAX-RON10真核表达质粒，免疫BALB/c小鼠，免疫三次后测定相应的体液和细胞免疫应答水平，并用弓形虫RH和PRU虫株进行攻虫感染；结果显示，两个实验组小鼠均可诱导机体产生良好的体液和细胞免疫应答，pVAX-RON5p核酸疫苗能够对弓形虫RH株和PRU株产生一定的交叉免疫保护力，而pVAX-RON10核酸疫苗对弓形虫急性和慢性感染均不能产生免疫保护力，因此RON5基因具有一定的免疫原性，可作为候选抗原用于进一步研制实用抗弓形虫疫苗。最后对12株来自国内外不同宿主与地理来源的弓形虫分离株的棒状体颈部蛋白5和10基因进行了遗传变异分析，结果表明弓形虫这两个基因在12个不同分离株中序列相对保守，不适合用于对弓形虫进行基因分型的遗传标记分子。研究成果将为抗弓形虫病新型疫苗、新药及新诊断检测技术研究取得新突破奠定基础。