翻转酶(Flippase)在丝状真菌蛋白分泌过程中的作用机制研究

Protein biosynthesis, modification, processing and secretion is one of the critical basic scientific questions in life sciences. Lignocellulose degrading filamentous fungi usually have a large capacity of protein secretion. However, little is known about the molecular mechanism behind this property. We recently obtained a hyper-secretion Neurospora crassa mutant strain through chemical mutagenesis and high-throughput flow cytometry screening. After backcrossing this mutant strain with the parental strain, Bulk Segregant Analysis (BSA) was used to determine the mutated genes associated with this hyper-secretion phenotype. Our results revealed that dysfunction of drs-2, which is a flippase encoding gene, could lead to increase the protein secretion level by nearly 3 folds. This project is designed to systematically study the molecular mechanism of how the relevant flippases affect protein secretion in N. crassa, by using molecular genetic methods, living cell imaging technology, secreted proteomics analysis and protein pulse chase analysis. Furthermore, we will investigate the functional conservation of this new discovery by checking their function in Trichoderma reesei. This project will not only help to extend the theoretical understanding of protein secretion in filamentous fungi, but also provide new clue for studies on filamentous fungi associated biomass utilization and carbon cycling.

蛋白质的生物合成、修饰加工以及分泌途径是生命科学领域重要的基础科学问题之一。木质纤维素降解类丝状真菌通常具有强大的蛋白分泌能力，但其背后的分子机制却缺乏系统研究。申请人以模式生物粗糙脉孢霉为研究对象，在前期工作中，通过化学诱变、流式细胞仪高通量筛选获得一株高蛋白分泌诱变株。将其与出发株回交，采用集群分离分析法获取与高蛋白分泌表型相关联的突变基因。我们的结果显示，一个翻转酶编码基因drs-2的功能缺失可使蛋白的分泌量增加近3倍。在此基础上，本项目拟在粗糙脉孢霉中，采用分子遗传学手段、活细胞成像技术、分泌蛋白组学分析以及蛋白的脉冲跟踪技术，系统研究相关翻转酶影响蛋白分泌的作用机制，并在里氏木霉中验证这一机制的功能保守性。本项目的开展不仅有助于加深人们对丝状真菌蛋白分泌的理论认知，同时也为丝状真菌在生物质降解利用、推进自然界碳素循环等方面的研究提供新的思路。

腐生丝状真菌是自然界木质纤维素物质的主要分解者，具有强大的蛋白分泌能力，但其背后的分子机制却缺乏系统研究。本项目以模式丝状真菌粗糙脉孢霉和纤维素酶工业生产菌株里氏木霉为研究对象，在前期粗糙脉孢霉中发现一个翻转酶编码基因drs-2的功能缺失可使蛋白的分泌量增加近3倍的工作基础上，进一步采用分子遗传学手段对翻转酶影响蛋白分泌的作用机制进行了系统研究。项目主要取得以下研究结果：1、粗糙脉孢霉中并不是所有翻转酶基因的缺失都影响蛋白的分泌，除drs-2以外，只有dnf-1缺失株呈现蛋白分泌量显著增加的表型。2、里氏木霉中，drs-2基因的缺失也可引起蛋白分泌量的显著增加，说明翻转酶DRS-2对蛋白分泌的影响在丝状真菌中具有一定的保守性。3、翻转酶DRS-2对蛋白分泌的影响与其底物特异性及其相关，底物特异性改变的drs-2突变基因无法回补drs-2缺失引起的高蛋白分泌表型。4、翻转酶DRS-2并不是影响所有分泌蛋白的表达分泌，drs-2基因的缺失选择性地提高了部分分泌蛋白的分泌量，并且这种影响发生在转录后的蛋白翻译、折叠及运输过程。5、粗糙脉胞霉和里氏木霉中，翻转酶均定位与菌丝的顶体位置，可能通过影响囊泡运输影响蛋白的分泌。6、构建了一株高蛋白分泌的里氏木霉菌株，为反向研究蛋白分泌量的增加对翻转酶功能的影响提供了实验材料。本项目实施过程中，发表研究论文3篇，申请发明专利1项，培养硕士研究生3名。目前，虽尚未完全揭示翻转酶与蛋白分泌之间的调控模式，但所取得的结果为其最终解析奠定了重要研究基础。本项目的开展以及目前已发表的部分研究结果将为丝状真菌蛋白分泌研究提供新的思路，在木质纤维素酶生产菌株的遗传改良以及真菌病害生物防治领域内具有重要研究意义。