增强子调控成牙本质细胞分化的研究

An enhancer is a short region of DNA that can be bounded with proteins (namely, the trans-acting factors, much like a set of transcription factors) to enhance transcription levels of genes (target genes )in a gene cluster. The aim of this project is to explore the function of enhancers during the process of odontoblastic differentiation. Primarily, ChIP-Seq of H3K4me3 has been completed in the preliminary study, then ChIP-Seq of H3K27Ac will also be applied to detect the candidate enhancers. Reporter gene’s plasmid will be employed to further test and verify the candidates in vitro. Also, the bioinformatics methods and reporter gene studies will predict and confirm the target genes of these enhancers. In addition, the transcription factors related studies will be conducted to investigate the interaction between transcription factors and these enhancers. At last, a representative enhancer will be selected by the zebrafish model and its fine tuning mechanism in odontoblastic differentiation will be studied in vivo by establishing the transgenic mice model. The achievements of this project will enforce the interpretation of the regulation of odontoblastic differentiation.

增强子（Enhancer），是DNA上一小段可与蛋白质（如转录因子等）结合的区域，与蛋白质结合之后，靶基因的转录作用将会加强。为研究成牙本质细胞分化过程中相关增强子及其作用，项目组基于前期H3K4me3 ChIP-Seq的结果，拟再利用 H3K27Ac ChIP-Seq 进行联合分析确定候选增强子，构建检测增强子活性的报告基因载体，体外验证增强子在胞内的活性,并进一步筛选成牙本质细胞分化特异的增强子序列；通过生物信息学分析和报告基因实验，预测并验证以上增强子的靶基因；利用转录因子相关实验手段探索转录因子与增强子的相互作用；最后采用斑马鱼模型快速筛选出一个代表性的增强子序列，利用转基因小鼠模型从体内水平研究增强子对于成牙本质细胞分化精细调控的机制。本项目研究成果将加深对调控成牙本质细胞分化的分子机制的理解。

成牙本质细胞起源于颅神经嵴细胞，在牙本质生成中发挥着至关重要的作用。胚胎发育和干细胞分化是由转录因子与DNA位点的时空特异性结合所调控，并伴随着染色质可及性以及组蛋白修饰的变化。然而，染色质可及性是否影响成牙本质细胞分化和转录因子如何调控成牙本质细胞向分化命运以及其机制仍旧未知。我们运用ATAC-seq 和 H3K27Ac CUT&Tag实验证明了体外成牙本质细胞分化前成牙相关基因相邻的染色质区域具有高可及性，在成牙本质细胞向分化诱导后，矿化相关基因附近的染色质区域打开并持续开放。我们进一步整合RNA-seq 和 ATAC-seq 的结果，证明了差异基因的表达水平与附近染色质的可及性高度相关。.总的来说，我们证明了在牙本质发生过程中染色质可及性的变化，并阐述这些染色质区域区域是如何通过动态调控来结合不同的 TF 家族，促进成牙本质细胞终末分化。我们的研究从体内外水平发现：①体外成牙本质细胞向分化与体内牙冠成牙本质细胞分化轨迹相当，证明我们利用小鼠牙乳头细胞系构建的牙本质细胞分化模型能够很好地模拟体内成牙本质细胞分化进程。②SALL1与RUNX2相互作用或直接激活TGF-β2信号通路来调控mDPCs的成牙本质细胞向分化的命运，促进成牙本质细胞分化。③ZEB1在成牙本质细胞分化时发挥双重作用，分化早期通过改变如Runx2等基因附近顺式作用元件的染色质可及性，分化晚期直接增强Dspp的转录，从而促进成牙本质细胞分化。④成牙本质细胞终末分化与bZIP转录因子家族结合染色质位点相关：家族成员ATF5可以提高Dmp1增强子的活性，从而促进成牙本质细胞终末分化；另一个家族成员ATF2通过磷酸化激活内源性乙酰转移酶活性，从而开启小鼠牙乳头细胞成牙本质细胞终末分化的矿化阶段。