miR-145和miR-143调控成牙本质细胞分化的研究

项目组采用miRNA生物芯片发现miR-145和miR-143在小鼠牙乳头细胞诱导分化为成牙本质细胞样细胞的过程中有显著下调。为了研究miR-145和miR-143对成牙本质细胞分化的调控机制，拟首先利用qRT-PCR技术验证两miRNA在成牙本质细胞体外分化的过程中表达特征，利用dFISH验证miRNA在小鼠成牙本质细胞分化各阶段中的表达。运用慢病毒感染和miRNA干扰探针分别研究两miRNA单独和共同过表达及抑制表达对成牙本质细胞分化的影响，并应用表达谱基因芯片寻找相应表达变化的基因。结合miRNA种子配对分析的结果预测两miRNA的下游直接调控基因，双荧光素酶报告基因进行验证。最后采用基因注释、SAM分析等，比较在牙乳头细胞中分别和共同过表达、抑制表达两miRNA后的表达谱芯片结果，以分析归纳出miR-145和miR-143协同调控成牙本质细胞分化的具体模式和机制。

本项目主要研究小鼠成牙本质细胞分化过程中microRNA调控作用及相关机制，其中重点研究了miR-145和miR-143对成牙本质细胞分化的抑制作用机制。项目组通过microRNA芯片筛选出miR-145和miR-143为小鼠成牙本质细胞分化前后表达下调最为明显地两个microRNA，并通过qRT-PCR和原位杂交验证了miR-145和miR-143在成牙本质细胞分化早期呈显著下调趋势。此后从gain-of-function和loss-of-function两方面研究miR-145和miR-143均能抑制成牙本质细胞的分化，而miR-143则部分通过miR-145途径抑制了成牙本质细胞的分化。双荧光素酶实验和挽救实验证明，miR-145通过直接结合于Klf4和Osx的3’UTR区域从而抑制后两者的表达进而抑制成牙本质细胞的分化。最后，项目组通过染色体共沉淀和双荧光素酶报告实验证明Klf4作为转录因子一方面能通过结合于Dmp1启动子区域促进Dmp1表达进而促进成牙本质细胞分化，另一方面能结合于miR-143启动子区域抑制miR-143表达从而促进成牙本质细胞的分化。此外，项目组建立了链霉素亲和素RNA配位体介导的RNA pull-dwon实验方法，从而快速的鉴定出在成牙本质细胞中结合于Klf4 3’UTR区域的所有miRNA以及let-7家族在牙乳头细胞中的富集程度，为今后建立成牙本质细胞分化miRNA调控网络的构建打下了实验基础。