农杆菌介导RNA干扰抑制核盘菌致病相关基因的研究

核盘菌是以同宗配合进行有性生殖的重要植物病原真菌，宿主范围广泛，造成巨大经济损失，核盘菌的相关研究成为植物病理学家关注的焦点。本项目以核盘菌为对象，以本课题组已建立的农杆菌介导核盘菌转化体系、与核盘菌有性生殖相关的SsMADS基因、核盘菌子囊盘表达序列标签为基础，搜寻靶基因siRNA位点，合成编码发夹RNA的模板DNA克隆到含有hpRNA表达元件的农杆菌双元载体上。利用农杆菌转化体系将靶基因hpRNA的表达盒整合到基因组中，实现siRNA体内持久转录，获得靶基因抑制突变株。分析mRNA、蛋白质表达水平，结合表型和致病力变化，阐明SsMADS基因功能，挖掘未知功能基因，为揭示核盘菌致病的分子机理，有效控制作物菌核病提供理论依据。同时，建立农杆菌转化与RNAi相结合研究基因功能的新策略，解决真菌siRNA导入的难题，延长RNAi作用时间，提高稳定性，为其他病原真菌基因功能研究提供借鉴。

核盘菌是以同宗配合进行有性生殖的重要植物病原真菌，宿主范围广泛，造成巨大经济损失。本项目以核盘菌为对象，以核盘菌子囊盘cDNA文库中筛选的MADS-box为靶基因，RNA干扰获得靶基因抑制突变株，阐明MADS-box基因功能，揭示核盘菌致病的分子机理。. 本研究获得结果：1. 克隆了核盘菌MADS-box基因SsMADS并登陆GenBank（No. FJ869956）；2. 选择SsMADS基因的保守片段，构建了靶基因的RNA干扰载体pS1-SsMADS（形成发卡结构）和pSD-SsMADS（带有对向启动子结构）；3. 建立了高效、稳定的核盘菌原生质体制备和农杆菌介导的转化体系；4. 通过转化将构建的RNA干扰载体转入核盘菌，并获得大量转化子；5. 对转化子进行筛选和分子验证获得一些表型改变突变株；6. 通过对转化子SsMAD基因表达量、菌株生长速率和致病力分析，表明MADS-box在核盘菌菌丝生长、致病力等方面具有重要的调控作用。. 本研究创新点与意义：1. 将农杆菌T-DNA插入与RNA干扰结合起来，用于核盘菌功能基因的研究，获得了性状稳定的转化子，为基因功能的研究提供新策略；2. 阐明了核盘菌MADS-box转录因子SsMADS在菌丝生长、致病力等方面的重要调控作用，为有效控制菌核病提供理论依据；3. 建立了稳定、高效的RNA干扰技术体系，为今后研究核盘菌基因功能奠定基础，也为其它病原真菌研究提供借鉴。. 对外交流：2012年6月邀请美国佛罗里达大学教授、美国植物病理学会病原真菌委员会副主席Jeffrey A. Rollins来吉林大学开展一系列学术交流活动，为核盘菌研究提出了宝贵建议。2012年、2013年、2014年课题组多名成员分别赴青岛农业大学、武汉华中农业大学、沈阳农业大学参加“中国植物病理学会学术年会”及“第十五届国际核盘菌研讨会”，与国内、外知名专家进行了广泛的学术交流并投稿。. 研究成果：培养研究生2名，发表SCI论文3篇，会议论文3篇。所指导的研究生毕业论文“核盘菌MADS-box转录因子SsMCM1功能的研究”被评为吉林大学优秀硕士论文，项目负责人被评为“吉林大学优秀硕士学位论文指导教师”。2013年课题组研究成果“核盘菌子实体形成机制及大豆菌核病综合防控技术的研究与应用”获吉林省科学技术一等奖。