松材线虫致病相关基因的克隆与RNA干扰研究

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害，由于该病的致病机理尚未弄清，目前还没有确实有效的防治措施。关于松材线虫致病机理的酶假说、空洞化假说和毒素假说，都只是在松材线虫与寄主互作过程中的生理生化等方面进行了研究，尚不能完全阐明该病的致病机理。因此，为了进一步深入揭示松材线虫的致病机理，最直接和有效的方法就是获取松材线虫致病过程中的关键功能基因信息，通过病程中关键基因的克隆与功能分析，了解松材线虫病致病的分子机制，从而阐明松材线虫病的致病机理，突破松材线虫病研究中长期未能解决的关键问题，为防治技术的研究提供理论基础。本研究将采用抑制消减杂交技术筛选与松材线虫的取食和线虫与寄主植物互作过程中的致病相关基因，采用RNAi技术对相关基因进行功能分析，同时结合基因生物信息学和表达组织位点等分析结果，阐明松材线虫致病过程中的关键基因及其作用机理，并探讨致病相关基因的RNAi在松材线虫病防治研究中的潜能。

1、项目对分别来自中国和日本的松材线虫和拟松材线虫虫株采用两条幼虫配对在葡萄孢基质上进行单异活体共培养的方法获得了14个遗传背景相对一致线虫家系。致病力测定表明，家系间的致病力分化明显，其中松材线虫家系AN19#F1的致病力最强。.2、以AN19#F1松材线虫混合虫体为测试方，线虫卵为驱动方，构建了二者差减cDNA文库，共获得松材线虫虫体特异表的有效EST序列354个，拼接后获得34个重叠群，其中的15个重叠群获得明确的功能注释，其中MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶、β- 1,4内切葡聚糖酶、锌指家族蛋白有较高的同源性，这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。同时项目还采用基因芯片表达谱分析技术筛查了松材线虫与寄主松树互作过程的致病相关基因，从松材线虫基因组和转录组数据库中合成了31121个寡核苷酸探针，其中633个基因在与黑松互作中上调表达，677个基因下调表达。功能注释分析发现包括果胶裂解酶、P450、UGTs和ABC转运因子等基因参与松材线虫与寄主的互作，功能主要包括参与植物细胞壁降解、解毒作用和线虫的繁殖，这些因为被认为是松材线虫致病的关键因子。.3、项目对松材线虫与寄主互作中高度表达的纤维素酶、类毒液过敏蛋白、14-3-3蛋白和主要精子蛋白等9个基因进行了全长cDNA克隆。对三个主要精子蛋白BxMSP1、BxMSP2和BxMSP3的组织表达位点分析发现，该类基因主要在雄成虫的输精管位置表达。.4、本项目采用RNA干扰方法对松材线虫致病相关基因类毒液过敏蛋白BxVAP3、内切纤维素酶BxENGL1和BxENG3、主要精子蛋白BxMSP1、BxMSP2和BxMSP3进行了RNA干扰研究，BxMSP1、BxMSP2的dsRNA能显著降低松材线虫的取食和繁殖力；内切纤维素酶BxENGL1和BxENG3的dsRNA显著降低了松材线虫的繁殖力，同时也显著降低了松材线虫对黑松的致病力。.5、针对松材线虫具有取食真菌的特点，项目对由真菌介导的松材线虫的RNA干扰进行了初步探索，建立了根癌农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌遗传转化体系，该体系的建立为松材线虫功能基因的持续干扰鉴定基础。.6、项目发表论文8篇，其中SCI论文2篇，中文期刊论文6篇。