突变型HIF1α修饰MSCs通过增强成骨和血管新生治疗股骨头坏死的实验研究

Promoting osteogenesis and angiogenesis is an ideal method for the treatment of femoral head necrosis. Studies have shown that HIF1α can promote MSCs differentiating into osteoblast and EPCs homing to the ischemic area, thereby enhancing osteogenesis and angiogenesis. But HIF1α is easily biodegradable under normoxic condition, resulting in weakened effects of itself. We got non-degraded HIF1α under normoxic condition by gene mutation methods. Preliminary study found that mutant HIF1α modified MSCs produce exosomes that promote angiogenesis. Thus, we hypothesize,in addition to promoting osteoblastic differentiation of MSCs and homing of EPCs to the ischemic site, mutant HIF1α modified MSCs produce exosomes which can enhance angiogenesis in necrotic area of bone. By cell culture, immunohistochemistry, western blot, flow cytometry sorting and animal experiments et al, we will study whether the mutant HIF1α modified MSCs promote differentiation of MSCs into osteoblast and homing of EPCs to the ischemic site, and further explore the mechanism that mutant HIF1α modified MSCs enhance the angiogenetic effects of EPCs by exosomes. It may provide a new way for the treatment of femoral head necrosis.

成骨和改善血供是治疗股骨头坏死的理想方法。研究表明HIF1α可促进MSCs向成骨细胞分化以及EPCs归巢至缺血区，从而促进成骨和血管新生。但HIF1α易降解，导致其作用减弱。我们通过基因突变方法获得在常氧下不易降解的HIF1α，初步研究发现突变型 HIF1α修饰的MSCs产生含有促进血管新生的外泌体。因此假设，突变型HIF1α修饰MSCs后，除了促进MSCs向成骨细胞分化以及EPCs归巢外，产生的外泌体可增强骨坏死区血管新生。本研究拟通过细胞培养、免疫组化、免疫印迹、流式细胞分析和分选、动物实验等，证明通过突变型HIF1α修饰MSCs，不仅促进MSCs的成骨作用，而且促进EPCs归巢；并进一步探讨突变型HIF1α修饰的MSCs通过外泌体增强EPCs血管新生的机制，为股骨头坏死的治疗提供新途径。

在HIF-1α编码序列（CDS）中携带三点（氨基酸402、564和803）突变的腺病毒转染骨髓源性间充质干细胞（BMSCs），得到在常氧条件下有效表达功能蛋白的突变HIF-1α编码序列。HIF-1α修饰的BMSCs在早期类固醇诱导的股骨头缺血性坏死（SANFH）具有积极的促进恢复作用。在项目研究中，我们首先获取并分析了由突变体和野生型HIF-1α修饰的BMSC衍生的外泌体BMSC-ExosMU或BMSC-ExosWT。体外实验，我们研究证明了由BMSC-ExosMU修饰的BMSC的成骨分化能力优于 BMSC-ExosWT；BMSC-ExosMU对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的血管生成作用更强于BMSC-ExosWT。体内实验，通过建立兔的类固醇诱导的股骨头缺血性坏死模型并向坏死区域注射BMSC-ExosMU或BMSC-ExosWT，实验结果表明通过重建和增强骨小梁，BMSC-ExosMU显著促进了血管生成和骨再生，促进了股骨头坏死的愈合。此外，BMSC-ExosMU以剂量依赖性方式刺激HUVECs的增殖、迁移和血管形成。这解决了HIF-1α在常氧条件下迅速降解的科学问题，为可控的HIF-1α持续作用治疗类固醇诱导的股骨头缺血性坏死提供了科学研究基础和实践依据。在软骨损伤方面，验证突变型HIF-1α修饰骨髓间充质干细胞（BMSCs）分泌的外泌体对软骨细胞的保护作用，阐明了其联合软骨再生支架促进晚期软骨缺损修复的可能机制。在体外，采用白细胞介素１β（IL-1β）诱导软骨细胞发生炎症反应，我们发现BMSC-ExosMU组软骨细胞凋亡小体数目低于BMSC-ExosWT组；软骨细胞中AKT/P-AKT活化增强、ERK/P-ERK和P38/P-P38表达水平减弱。建立兔膝关节软骨缺损模型，比较发现软骨支架与BMSC-ExosMU共同作用于软骨缺损处可促进缺损修复。但是突变体HIF-1α静脉用药和优秀的成血管作用使BMSC-ExosMU在动物实验中产生了一些不良后果，如血管瘤和关节滑膜大量增生。通过基因相互作用网络查询系统，找到与HIF-1α直接相关的非编码小RMA（miRNA）若干，我们经过筛选和实验，发现与成血管相关的miR-126和与炎症相关的miR-27b在股骨头坏死和关节炎症方面具有重要的调控作用，风险性更低。