hCGRPα基因修饰BMSCs联合自体骨移植治疗股骨头坏死的实验研究

股骨头坏死是一种严重威胁人类健康的常见病，致残率高，疗效不佳。治疗的关键是：加速成骨与增强骨修复。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是治疗ONFH最理想的种子细胞，转基因BMSCs可大大促进其增殖，"良性基因+BMSCs+骨移植"具有明显优势。目前采用的良性基因有bFGF、VEGF、BMP-2等，而与骨生长、代谢和修复密切相关的神经肽基因尚未得到应用。最新研究表明降钙素基因相关肽（CGRP）可明显促进BMSCs的增殖与成骨分化。本项目拟应用重组逆转录病毒载体pLNCX2- hCGRPα，将hCGRPα基因导入兔BMSCs，并联合自体骨支撑植入动物模型的股骨头内，即转基因BMSCs+松质骨与骨柱移植术，以期加速成骨、增强骨修复，达到高效治疗ONFH的目的。本课题从发病机理上为干细胞治疗ONFH寻找到了促进成骨的新基因，开创新的科研思路治疗ONFH。将具有广阔的应用前景、巨大的社会效益和经济效益。

股骨头坏死的治疗关键是加速成骨与增强骨修复。为了探索促进成骨的新基因和优效治疗ONFH的新基因疗法，本项目构建重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα，将降钙素基因相关肽hCGRPα基因导入兔BMSCs，并联合自体骨支撑植入动物模型的股骨头内，探讨其治疗ONFH的效果。 .我们的实验结果显示：（1）成功构建重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα，菌液测序结果与GenBank公布的DNA序列一致。重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα转染到PT67细胞进行包装，其产生的病毒上清液感染NIH3T3细胞，获得稳定表达，制备出高感染效率的重组逆转录病毒滴液，病毒滴度为1.7×106pfu/mL。（2）细胞学实验：分离培养获得家兔体外BMSCs，成功将重组逆转录病毒感染第2代BMSCs，转基因细胞中hCGRPα基因呈高表达，细胞增殖速度加快，细胞中ALP活性增高，胶原、骨钙素、层粘连蛋白等含量均明显高于各对照组，P<0.05。表明神经肽hCGRPα基因可提高BMSCs的成骨活性，促进BMSCs成骨分化。（3）动物学实验：采用液氮冷冻法成功制作出家兔股骨头坏死动物模型，设计hCGRPα基因修饰BMSCs联合自体支撑骨植入动物模型股骨头内，转基因BMSCs可持续表达hCGRPα，股骨头细胞内hCGRPα、Osteocalcin的mRNA与蛋白均呈高表达，均明显高于各对照组，P<0.05。股骨头的病理组织学结果显示：转基因BMSCs组中，股骨头内大量骨细胞增殖生长，骨小梁较成熟，排列基本规则，骨小梁面积分数百分比高、空骨陷窝计数百分比低，股骨头骨组织的最大压缩强度和平均弹性模量增高，均优于各对照组，P<0.05。.结论：（1）成功出构建重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα。（2）成功将重组逆转录病毒感染BMSCs，hCGRPα基因加速细胞增殖，提高BMSCs的成骨活性，促进其成骨分化。（3）hCGRPα基因修饰BMSCs植入动物模型股骨头内，可持续表达hCGRPα，促使股骨头内BMSCs快速增殖、提高成骨效率，加速成骨、促进骨修复，增强股骨头的生物力学性能。证明了神经肽基因促进成骨治疗ONFH的优良效果。（4）本研究开创新的科研思路治疗ONFH，从采用干细胞治疗ONFH中发现了促进成骨的一个新基因hCGRPα，它将具有广阔的研究应用前景。