富集自体外周血MSCs移植治疗兔股骨头坏死的实验研究

近年来的研究表明，人、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔等动物的外周血（PB）中均存在具有多向分化能力间充质干细胞（MSCs），称为外周血间充质干细胞（PBMSCs）。我们对早期股骨头坏死病例采用自体外周血单个核细胞（PBMNCs）移植治疗，获得了良好的临床治疗效果，推测与人PBMNCs中存在的PBMSCs有关。但目前尚无PBMSCs移植修复实验性股骨头坏死的研究证据可循。本研究拟制备兔股骨头坏死模型，通过移植菲立磁（Feridex）标记兔PBMSCs，采用磁共振成像对移植PBMSCs的体内迁移情况进行活体细胞示踪；另用BrdU标记的PBMSCs研究移植PBMSCs的体内存活、分化和组织再生能力；X线检测骨密度、新生骨小梁等病损修复情况。通过上述实验，有望揭示模型移植中PBMSCs的体内迁移及转归，这可为评价PBMSCs的临床应用价值及今后外周血作为MSCs的新来源而推广应用提供新的有价值的实验依据。

本研究采用G-CSF动员的家兔外周血中分离、培养外周血间充质干细胞（PBMSCs），并对其表型特征和分化能力进行鉴定；采用兔外周血单个核细胞（PBMNCs）集落培养，对家兔PBMSCs集落形成率（CFE）进行分析，用以确证家兔是否存在PBMSCs及其含量。结合髓心减压术，将富集的PBMSCs原位移植到液氮冷冻兔股骨头内，并于移植术后不同时间点进行髋关节X线摄片、股骨头石蜡组织HE染色和股骨头PPAR-γ、BMP-2 mRNA荧光定量PCR表达分析，以评价PBMSCs作为移植治疗股骨头坏死供体细胞新来源的应用价值及初步的作用机制。主要研究结果：①家兔PBMSCs呈长梭形漩涡状生长，表达CD29、CD105、CD44、CD90及波形蛋白，不表达CD34、CD45和CD14。培养PBMSCs倍增时间为37.4 h。动员后的家兔PBMSCs存在频率为每百万个PBMNCs中有2.8~10.8个，而未动员组仅为0～3个。②家兔PBMSCs具有成骨、成软骨和成脂等中胚层系分化能力，适宜条件下还可跨系分化为神经元和肝样细胞。③移植疗效X线摄片：6 w时，髓心减压+PBMSCs移植组股骨头密度高于髓心减压组，并在8 w时出现正常的骨小梁结构。④移植疗效的组织病理学分析：4 w时，髓心减压和髓心减压+PBMSCs移植两组钻孔区均出现较多新生骨小梁和骨髓组织；8 w时髓心减压组钻孔区内出现大量骨髓组织，骨小梁分布不均，而髓心减压+PBMSCs移植组钻孔区内骨小梁已趋成熟，并见大量骨髓组织。⑤模型组各时间点股骨头内PPAR-γ mRNA的表达量均高于正常组，且随时间的推移其表达量呈上升趋势；髓心减压组和髓心减压+PBMSCs移植组PPAR-γ mRNA的表达量在各时间点均明显低于模型组，8 w时髓心减压+PBMSCs移植组PPAR-γ mRNA表达量明显低于髓心减压组。模型组各时间点BMP-2 mRNA的表达量明显低于正常组；8 w时，髓心减压+PBMSCs移植组的表达量明显高于相髓心减压组。结论：动员家兔外周血中可富集PBMSCs，适宜的诱导培养条件下可向成骨、成软骨、成脂细胞分化，并具有向肝样细胞和神经元样细胞跨系分化的潜力。联合PBMSCs移植对股骨头坏死的修复作用优于单纯髓心减压的修复效果，这一治疗作用与移植PBMSCs后降低股骨头局部PPAR-γ表达，并提高BMP-表达有关。