一株对家蚕具有高致病性的变形微孢子虫与家蚕微粒子虫的比较病原学研究

Silkworm pebrine is the only one disease listed for quarantine in world silkworm-feeding country， its transovarial transmission(TT) result in a big loss for silkworm feeding, however, the TT mechanism is still unknown. Here we isolated a micropsoridia with high virulence to silkworms. After characterization of its morphology, sub-cell structure, and rDNA sequence, the isolate was identified as Vairimorpha bombycis, however, it showed very low capability in TT, quite different with Nosema bombycis, which show high ability in TT. These two parasites form a nice pair to explore the mechanism of TT. In this proposal, we try to explore protein agent involved in the TT through the comparative etiolgoy of these two parasites. The contents consist of three parts: 1,the survey of host spectrum and capability of vertical transmission; 2,genome survey by Solexa sequencing, and characterization of the invasion and virulence related genes, such as spore wall proteins and polar tube proteins; 3,test the binding ability of these invasion related protein to ovary of silkworm. Our aim is to obtain the molecular clues of the TT mechanisms and the pathogenicity basis of microsporidia, and provide more data for identification of Vairimorpha bombycis in silkworm feeding.

家蚕微粒子病是家蚕微粒子虫引起的惟一法定检疫疫病，其经胚种垂直传播（胚传）对养蚕业造成严重危害，而垂直传播的机制还不清楚。最近我们从病蚕中分离出一株对家蚕有高致病力，可引起典型家蚕微粒子病征的微孢子虫，对其形态、超微结构、rDNA序列等鉴定后，命名为家蚕变形微孢子虫（Vairimorpha bombycis），同时发现其胚传能力很弱，与家蚕微粒子虫完全不同。这两种微孢子虫组成了一对研究胚种传播的良好材料。本研究以家蚕微粒子虫为参照，拟通过比较病原学方法探究二者在胚传能力上差异。研究内容包括：对该变形微孢子虫的宿主谱、胚传特性进行比较研究；采用SOLEXA分析技术对其基因组进行扫描，开展其与家蚕微粒子虫的比较基因学分析，对其侵染相关蛋白（孢壁蛋白、极管蛋白）进行鉴定；并进行侵染相关蛋白与家蚕卵巢组织（细胞）的结合实验，鉴定胚传相关因子，为揭开微孢子虫垂直传播机制奠定理论基础。

家蚕微粒子虫（Nosema bombycis，Nb）是家蚕典型的胞内寄生病原，其经卵垂直传播会给养蚕业带来重大经济损失。本实验室从病蚕分离的变形微孢子虫分离株对家蚕有较强的致病性，但其不能经卵垂直传播。因此，开展Nb及变形微孢子虫分离株的比较病原学研究对揭示经卵垂直传播机制具有重要意义。对变形微孢子虫超微结构、生活史以及分子系统发生分析表明该微孢子虫与纳卡变形微孢子虫聚为一类，将其命名为纳卡变形微孢子虫家蚕分离株（Vairimorpha necatrix BM，VnBM ）。VnBM对家蚕的毒力与Nb相似，对家蚕具有很高的杀伤力，二者均可感染家蚕的中肠、脂肪体、丝腺、马氏管和精巢。两种病原最大的差异在于Nb可以感染卵巢而VnBM不能。VnBM感染的母蛾所产蚕卵及孵化的子代体内均无微孢子虫感染，确证VnBM不能经卵垂直传播。病理切片显示被VnBM感染病蚕的卵巢组织中在整个幼虫阶段均无VnBM的存在，而Nb在感染12天后在病蚕卵巢组织中出现，但在幼虫阶段Nb只存在于卵巢上皮组织中，并未进入卵管。扫描电镜结果表明，Nb进入卵管发生在蛹期。VnBM在家蚕卵巢细胞系和家蚕胚胎细胞系中均能增殖，表明VnBM不感染卵巢并非是其不感染卵巢细胞造成。利用二代测序对VnBM进行全基因组测序，组装获得4830条Scaffolds，总长度为13.6 Mb，GC含量为28.01%，注释得到2703个编码基因，具有功能注释的基因共715个。两种微孢子虫侵染相关重要蛋白的比较发现, VnBM的这些蛋白在组成上与家蚕微粒子虫相似，包含了较多的孢壁蛋白以及分泌型蛋白，但在两种微孢子虫中的这些蛋白家族的拷贝数和氨基酸序列具有较大的差异，可能与其不同的病原特征有关。实验发现，两种微孢子虫的孢壁蛋白与家蚕卵黄原蛋白（BmVg）的结合能力存在差异，而初步研究证明BmVg介导的胞吞与Nb的垂直传播相关。我们的工作为揭示微孢子虫垂直传播的分子机制提供了重要线索，本项目的部分研究成果已被Infection and Immunity, Database，BMC Genomics等国内外知名杂志接收或发表，相信后续还有更重要的成果发表，希望本项研究能继续得到国家自然科学基金的支持。