家蚕微孢子虫高效遗传操作系统的建立

Pebrine is a major threat to sericulture worldwide, causing severe economic loss. Nosema bombycis is the causal agent of pebrine, research on Nosema bombycis is a hotspot in sericultural sciences, however, understanding important biological process of Nosema bombycis is still limited by our current inability to genetically manipulate these parasites. A series of genome editing techniques like CRISPR/Cas9 have been developed in recent years and successfully applied in many organisms, the development of DNA transformation techniques would likely lead to breakthrough in microsporidia genetics. Herein, we aim to develop a high efficiency genetic manipulation techniques of Nosema bombyces based on novel genome editing techniques system together with optimized DNA transformation and transformant screening techniques, which will provide new tools for functional analysis of important genes and elucidation of pathogensis and infection mechanism.

微粒子病是家蚕最重要的传染性疾病，给蚕丝业造成了重大经济损失。家蚕微孢子虫是微粒子病的主要病原，是蚕业科学研究领域的热点，其遗传操作体系的缺乏，严重阻碍了对其基因功能、致病机理与垂直传播等科学问题的深入研究。随着基因组编辑技术的发展，CRISPR-Cas9等技术被应用到多种生物中并成功实现了基因组精确修饰，为突破微孢子虫遗传操作瓶颈提供了思路与方法。本课题旨在利用新型基因组编辑技术，通过与多种DNA转化技术和筛选富集技术组合并进行评估优化，建立高效稳定的微孢子虫遗传操作体系用于基因敲入与敲除，为微孢子虫重要基因功能的研究提供新的工具。

微粒子病是家蚕最重要的传染性疾病，给蚕丝业造成了重大经济损失。家蚕微粒子虫是微粒子病的主要病原，是蚕业科学研究领域的热点。然而，遗传操作方法的缺乏严重阻碍了对家蚕微粒子虫基因功能、致病机理与垂直传播等重要科学问题的深入研究。基因导入技术是微孢子虫遗传操作体系创建的基础，本研究通过对基因枪、电击转化、脂质体转化和壳聚糖纳米颗粒转化等一系列外源DNA导入技术进行测试评估，最终确定了脂质体转化法是最适用于家蚕微粒子虫的DNA导入技术。筛选富集方法是限制微孢子虫遗传操作技术发展的核心难题，通过对现有的具有抗性基因的抗生素进行筛选发现，多菌灵、G418、壮观霉素和烟曲霉素等抗生素对家蚕微粒子虫具有抑制作用。随后通过导入携带了相应抗性基因的转基因载体并辅以抗生素筛选，我们发现转染携带了源自酿酒酵母MAP1基因载体的感染细胞中，添加烟曲霉素进行抗性筛选后，转基因家蚕微粒子虫的比例开始上升，证明MAP1基因可以作为烟曲霉素的其抗性基因，用于转基因家蚕微粒子虫的富集筛选，这是首例目前首例关于微孢子虫抗性标记的研究。此外，通过实验还证明了RNA干扰技术可以抑制感染细胞中家蚕微粒子虫特异基因的表达，丰富了家蚕微粒子虫遗传操作系统的工具库。本项目的部分研究成果已被Journal of Invertebrate Pathology和Frontiers in Microbiology等国际知名杂志发表，相信后续还有更重要的成果发表，希望本项研究能继续得到国家自然科学基金的支持。