温度响应性识别RGDS肽和胰岛素的双分子印迹表面用于细胞片层技术的研究

Harvesting intact cell sheets by using thermo-responsive culture substrates holds great promise in scaffold-free tissue reconstruction. In view of the limitation of cell source and the timeliness of treatment in clinical applications, it is very important to promote cell adhesion, accelerate cell proliferation and cell sheet detachment during cell sheet culture. Previous studies have shown that introducing a cell adhesive peptide RGDS or a growth factor insulin into the thermo-responsive culture substrates can markedly improve cell adhesion or proliferation, respectively. However, drawbacks exist with such approaches, including instability of physical absorption or covalent bond decelerating cell detachment. The proposed project aims to address these concerns by fabricating a thermo-responsive, bimolecularly imprinted culture surface through surface coating of a mixture of molecularly imprinted nanoparticles towards RGDS and insulin respectively. In this approach, the bioactive molecules will promote cell adhesion and proliferation during cell culture, while they can be released from surface by lowering temperature, which facilitates the detachment of matured cell sheet. Therefore, this technique has advantages by improving the efficiency of cell sheet detachment, reducing the need of cell dosage, and shortening the harvesting time of cell sheets. In the study, we will work out a technical route for preparation of thermo-responsive bimolecularly imprinted surfaces and investigate the role of such surfaces in cell sheet culture. We expect that the proposed work will lead to a novel approach to introducing bioactive molecules on cell culture substrates and promote the clinical applications of cell sheet engineering.

采用温敏性基材培养并收获无损伤细胞片层的技术在无支架材料的组织重建方面具有良好应用前景。考虑到临床应用时种子细胞来源限制及治疗的时效性，在进行细胞片培养时，提高细胞贴附率以及加快细胞增殖和细胞片分离尤为关键。通过引入细胞粘附肽RGDS和生长因子胰岛素可分别促进细胞贴附和增殖，却存在如物理吸附方式不牢固、共价结合不利于细胞分离的缺点。针对这一问题，本研究拟采用分子印迹纳米粒子的表面涂层技术，构建对RGDS和胰岛素均具有温度响应性识别能力的双分子印迹表面，旨在通过特异性识别作用结合RGDS和胰岛素，有效促进细胞贴附和增殖，并能在降低温度时将其释放，提高细胞片层的分离效率，最终达到减少种子细胞需求、提高细胞利用率、缩短细胞片层收获周期的目的。研究中将探讨温度响应性双分子印迹表面的制备技术及其在细胞片培养和分离过程中的重要作用，有望为生物活性分子的引入方式提供新的思路，推进细胞片层技术的临床应用。

本项目首次采用了分子印迹的方式动态结合生物活性分子，构建了温度敏感的动态生物界面，并用于收获细胞片层。细胞片层技术在无支架材料的组织工程领域具有重要的实际应用价值。我们采用分子印迹技术合成了对细胞粘附肽 RGDS 具有温度响应性识别能力的分子印迹水凝胶薄层，通过特异性分子识别作用将 RGDS 结合在其表面并用作细胞片的培养基材。研究结果显示，通过这种特异性分子识别作用结合的生物活性RGDS 肽，可以有效改进细胞培养基材表面的生物相容性，并能通过温度变化调控生物活性分子的吸附与释放，不仅可以有效促进细胞贴附和增殖，还能提高细胞片层与材料的分离效率。此研究有望加快推进细胞片组织工程技术在临床上的应用，而且对于改进目前细胞培养基材表面功能化生物活性分子的方式、拓展分子印迹技术在生物医学领域的应用均具有重要意义。此外，我们还采用葡萄糖和温度双敏感性的聚合物材料，即使用含有苯硼酸基团的聚N-异丙基丙烯酰胺PNIPAAm水凝胶层作为细胞培养基材，可以通过改变细胞培养基中糖浓度以及体系温度来调节PNIPAAm 的相转变温度，实现糖浓度和温度的双重变化来改变材料表面性能，最终达到低损伤或无损伤收获细胞片层的目的。这一新的收获细胞片层的方式不仅可以更加有效加快细胞片层的分离，而且还可以在减少温度的降低幅度或不改变温度的条件下收获细胞，有利于克服由温度降低带来的不利于保持细胞活性的缺点。基于这一结果，我们为了模拟ECM的动态本质，构建动态的生物界面，已经尝试通过组织环境中的条件变化来调控细胞的贴附行为。我们采用RAFT可控聚合制备出含有葡萄糖基团的聚合物并将RGD肽接在其端基，同时采用表面引发的ATRP可控聚合制备出含有苯硼酸基团的表面基材。并通过多重可逆共价化学键的方式，将端基RGD的含糖聚合物动态结合在苯硼酸聚合物接枝表面，实现了通过改变血糖浓度差别来调控细胞粘附性能的效果。研究表明，细胞在这类生物界面的粘附行为可以通过改变细胞培养基中的糖浓度来实现，而且这一动态的过程表现出细胞外基质的可逆性。这项探索性研究对于细胞生物学的基础理论研究以及再生医学领域的人工细胞外基质的设计和发展具有重要的指导作用。