白色念珠菌PAMPs激活小鼠中性粒细胞Rac信号通路形成NET及其逃逸机制的研究

NET是中性粒细胞清除念珠菌感染的一种新型防御机制。研究表明ROS对NET形成至关重要，微生物又通过产生DNase等途径阻止NET形成并增强其致病力。本课题组前期研究发现ROS形成关键分子Rac与NET的形成密切相关，同时两种小鼠中性粒细胞对三株白色念珠菌杀伤力有明显差异，从而导致其致病力不同。我们推测该差异是由不同白色念珠菌株激活Rac信号通路诱导NET形成的能力及其逃逸NET诱捕的能力不同所导致。本研究拟采用透射电镜、共聚焦扫描显微镜等技术比较三株白色念珠菌诱导NET形成的能力；免疫荧光检测白色念珠菌PAMPs分布表达特点；单克隆抗体阻断、基因敲除小鼠等技术验证PAMPs对Rac信号通路及NET形成的影响作用；通过分子克隆获取念珠菌DNase及过氧化物酶，研究其对逃逸NET杀伤的影响作用。本研究的结果将为阐释三株白色念珠菌致病力差异的机制以及临床抗念珠菌感染治疗提供新思路。

本课题首先检测和比较了念珠菌易感小鼠CBA/CaH与耐受小鼠BALB/c中性粒细胞的Rac1的表达量、ROS和DNA释放量，确定了Rac1在NETs形成机制中的地位。然后，进一步研究了白色念珠菌 PAMPs 激活人类中性粒细胞 Rac 信号通路形成 NET，通过人类中性粒细胞分别与两株白色念珠菌SC5314和3683共培养，得出两株念珠菌均能成功诱导出NETs；通过免疫荧光共聚焦显微镜观察，发现两株念珠菌诱导出的NETs存在差异，其中SC5314诱导出的NETs最多，3683较少。通过Western blot和 荧光酶标仪检测到念珠菌与中性粒细胞共培养后，SC5314组 Rac1 和ROS表达水平高于3683组，由此证实了ROS 和Rac 与 NET 的形成密切相关，同时也对两株念珠菌致病力差异做出了解释。.为了进一步研究两株白念刺激中性粒细胞的形成NETs差异原因，检测了选择了白色念珠菌多个PAMPs，最后筛选出两个差异比较明显的抗原ADH 和Enolase，通过免疫荧光、Western blot发现SC5314的表达量较3683/3630均高；进而根据ADH，Enolase基因序列构建载体，原核表达重组蛋白，得到纯化重组ADH和Enolase，并用重组蛋白刺激中性粒细胞，结果显示均可诱导出NTEs，初步检测了其对中性粒细胞ROS的合成量及Rac信号通路的影响，实验正在进行中。同时进行了白色念珠菌对中性粒细胞逃逸机制的研究，通过DNA电泳检测到两株念珠菌与中性粒细胞共培养上清中均有DNase，进一步通过单相酶扩散法对其定量发现SC5314组DNase的表达量较3683组高，提示SC5314对NETs的逃逸作用更强，也进一步解释了SC5314的致病力较3683强；为了证实这一结果，体外克隆表达纯化了重组DNase，其在逃逸过程中的作用实验研究正在进行中。本研究的重要发现是：白色念珠菌PAMPs可激活中性粒细胞Rac信号通路形成NET，而且白色念珠菌可分泌DNase逃逸NETs的捕捉。研究结果已发表SCI论文3篇，待发表一篇。培养研究生5名，其中3名已取得硕士学位，2名在读。项目投入经费65万元，总支出59.2913万元，各项支出基本与预算相符，结余5.7087万元，结余经费将用于后续研究和支付论文撰写、发表等开支。