基于基因敲除小鼠研究中性粒细胞自发死亡的分子机制

Neutrophils are the most abundant cell type among circulating white blood cells and normally have a very short life-span (7-20 hours in blood and 1-4 days in tissue),they are also the key innate immune cells, which constitute the first line of host defense against pathogens. Neutrophils readily undergo spontaneous programmed cell death and this death program plays a crucial role in neutrophil homeostasis and the resolution of inflammation. However, the molecular mechanism underlying neutrophil spontaneous cell death is ill defined. Thus, based on the Preliminary Studies, and to further understand the involvement of Ptdlns(3,4,5)P3/Akt signaling in neutrophil spontaneous death, we continued to characterize the molecular mechanisms by which Ptdlns(3,4,5)P3/Akt activity is down regulated during neutrophil spontaneous death. Moreover, the downstream mechanisms responsible for Ptdlns(3,4,5)P3/Akt deactivation- mediated neutrophil death and the contribution of Ptdlns(3,4,5)P3/Akt pathway to neutrophil death in live animals （including knockout mice）were investigated. The specific aims of this study are as follows: (1) To elucidate the molecular mechanisms by which PI3Kγ activity is down-regulated by ROS during neutrophil spontaneous death. (2) To examine the role of NADPH oxidase-mediated ROS production in neutrophil death in animal models. (3) To continue to define the downstream mechanisms responsible for Akt deactivation-mediated neutrophil spontaneous death. From this study,better understanding of the molecular mechanisms underlying neutrophil spontaneous death will be demonstrated, and a novel cellular mechanism for CGD pathogenesis will be provided. In addition, defining the molecular basis of neutrophil spontaneous death will discover novel therapeutic targets and assist us to design novel clinical procedures for handling infection and inflammation or other diseases related to the impaired regulation of neutrophil apoptosis.

中性粒细胞是机体中数量最多、寿命最短的一类免疫相关细胞，在非特异性细胞免疫中起着十分重要的作用。自发死亡是中性粒细胞死亡的主要形式，是维持中性粒细胞体内平衡和促进炎症消退的主要方式，但是到目前为止，自发死亡的分子调控机制还不十分清楚。为此，基于以前的工作基础，我们将在多种基因敲除小鼠体内外深入研究ROS和PtdIns(3,4,5)P3/Akt信号在中性粒细胞死亡中的作用机制，重点关注三个问题：即是ROS是通过怎样的作用机制来抑制G-肌动蛋白聚合成F-肌动蛋白，阻断PI3Kγ的活化路径的？在动物体内，ROS是否还能介导中性粒细胞的死亡,其中又是怎样的作用机制？中性粒细胞自发死亡过程中PI3Kγ-PIP3-Akt信号通路的下游分子是哪些？本研究的完成将阐明中性粒细胞自发死亡的分子调控机制和信号途径，发现遗传性疾病CGD的新的分子致病机理，同时也为临床今后治疗多种感染和炎性疾病提供新的治疗靶点。

中性粒细胞是天然免疫系统中一类高度专职化的免疫细胞。自发死亡是中性粒细胞死亡的主要形式，是维持中性粒细胞体内平衡和促进炎症消退的主要方式，但是到目前为止，自发死亡的分子调控机制还不十分清楚。因此，该研究基于以前的工作基础，在多种基因敲除小鼠体内外深入研究ROS和PtdIns(3,4,5)P3/Akt信号在中性粒细胞死亡中的作用机制，以及寻找中性粒细胞自发死亡的新的分子调控机制。至今，该课题取得了一些突破性研究进展，具体如下：1.衰老的中性粒细胞中的ROS的积累提高了胞浆中的肌动蛋白的谷胱甘肽化水平,使得 G-actin不能聚合成F-actin,,从而影响了F-actin-PI3Kγ-PIP3-AKT活化途径,促进了细胞的凋亡的发生。酸性环境（pH 6.0）能使中性粒细胞中NADPH氧化酶的活性受到抑制，产生过氧化氢的能力显著降低，导致细胞的吞噬能力，极化能力，趋化能力均有所增强，但杀菌能力却减弱。ROS缺陷的中性粒细胞（来自CGD小鼠）在体外培养时表现为F-actin水平降低缓慢和细胞凋亡的延迟。而Grx1蛋白可以将谷胱甘肽化的肌动蛋白还原，增强了F-actin-PI3Kγ-PIP3-AKT活化途径，促进中性粒细胞的存活。来自于Grx1基因敲除小鼠的中性粒细胞表现为细胞凋亡的加速，其胞内存在高水平的谷胱甘肽化肌动蛋白；如将Grx1基因导入中性粒细胞，则可以延迟细胞的凋亡。2.吸烟和尼古丁可以减少细胞内的InsP7的产生，从而间接地减少了竞争性负调控AKT反应，增进了AKT膜转位和活化水平，延迟了中性粒细胞的衰老和死亡。3. 在衰老的中性粒细胞中，caspase-3的活化可以不依赖caspase8/9，我们在研究中率先发现中性粒细胞的自发死亡可以由胞浆内的一种丝氨酸蛋白酶，即是蛋白酶3(protein 3,PR3)，剪切procaspase-3来介导。该研究阐明了中性粒细胞自发死亡速率与AKT的活化水平高度相关性，揭示了中性粒细胞自发死亡过程中引起caspase-3切割和激活的一种新的机制，同时也为临床今后治疗多种感染和炎性疾病提供了新的治疗靶点。