芽孢杆菌中性植酸酶热稳定性机理及分子改造研究

中性植酸酶是一种新型绿色饲料用酶，对于减轻因水产动物高磷粪便导致的环境污染有着极其重要的意义，但高温失活问题已经成为制约其广泛应用的瓶颈。本项目以芽孢杆菌中性植酸酶为研究对象，结合计算结构生物学与基因工程等前沿技术，旨在系统的研究其热稳定性的分子机理，并通过理性设计获得具有高热稳定性的突变酶。通过精确构建中性植酸酶与底物复合物的模型，研究该酶与底物相互作用模式；基于上述结果采用分子动力学模拟方法，从原子水平上探讨温度及钙离子对其结构的影响；运用量子力学/分子力学方法对各种突变酶模型进行筛选；通过高效表达体系的构建和定点突变获得突变酶。对计算模拟的结果与突变酶的性质进行归纳，总结其热稳定性的分子机理。本课题的顺利开展，将会解决中性植酸酶在高温制粒和杀菌过程中活力损失较大的关键问题，而且为理解植酸酶的结构与功能关系提供坚实而富有新意的理论基础。

中性植酸酶是一种新型绿色饲料用酶，对于减轻因水产动物高磷粪便导致的环境污染具有极其重要的意义。本项目以芽孢杆菌中性植酸酶为研究对象，结合生物信息学与基因工程等前沿技术，旨在通过序列及结构分析设计获得具有较高活性及热稳定性的综合性能提高的突变酶并揭示其热稳定性的分子机理。. （1）克隆到新型淀粉液化芽孢杆菌DSM 1061的植酸酶基因（GenBank登录号为HM747163），对其序列及结构进行分析及同源模型的构建，并在大肠杆菌中进行了高效表达，利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。酶学性质研究表明，野生酶最适温度为65 °C，最适pH为7.0，最大比活为15.5 U/mg。65 °C时以植酸钠为底物的Km值为0.30 mmol/L。（2）通过精确构建中性植酸酶与底物复合物的模型，研究了该酶与底物相互作用模式；采用分子动力学模拟方法，从原子水平上探讨温度及钙离子对其结构的影响。结果表明，最佳配体构象与受体结合自由能为-10.0322 KJ/mol，酶活性中心Lys76、Arg122、Tyr159、Lys179、Glu211和Asp314对促进和稳定底物植酸的结合起到了重要的作用。分子动力学模拟结果显示，随着温度升高，残基的B因子增加，柔性增大，但活性中心结合与Ca2+后，残基的B因子普遍降低。然而，47-52、76-78、135-142、148-149、338-345等残基片段B因子值普遍较高，保持较大的柔性。（3）结合序列及结构分析结果，运用定点突变技术，获得多个活性提高的突变酶并对其性质进行了研究。其中，突变体D148E活性比野生酶提高了37.5%；基于以上结果设计的突变酶D148E/H149R的活性为野生酶的2.19倍； 突变酶D191E热稳定性显著提高，半失活温度比野生酶提高了4.5 ℃，半衰期提高了4.3 min。圆二色谱分析显示，突变酶D148E/H149R构象变化较大，其中α-螺旋的含量与野生酶相比明显降低。（4）与未添加热稳定剂的植酸酶相比，添加糖类能对酶的稳定性起到较大幅度的改善。在80 °C以上受热条件下，海藻糖的保护性能大于麦芽糖、蔗糖、葡萄糖及淀粉等。. 研究结果为进一步深入理解芽孢杆菌中性植酸酶结构与功能之间的关系提供参考。同时，获得的多种活性显著提高的突变酶，也为中性植酸酶的应用推广奠定基础。