脾脏FRCs在新布尼亚病毒致死性感染中自噬机制研究

Fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS) caused by SFTS virus (SFTSV), is one of the most important tick borne infectious diseases found by our scientists in China. The disease is widely distributed with a high mortality and the pathogenesis is unknown. The applicant and other scientists found the target cells of lethal SFTSV infection are mainly the spleen cells of reticular fiber (FRCs), indicating that FRCs infection is the main cause of death. Autophagy is the first degradation reaction of host against microbial pathogens. Based on the previous researches on SFTSV escape from host type I interferon, the co-localization of Rab5 and “cytoplasmic structures "induced by NSs, and the co-localization of FRCs-LC3 and SFTSV, our group think that a comprehensive understanding of SFTSV and autophagy process of FRCs can help to reveal the mechanisms of virus escape and death. This project will use the established FRCs cell line to conduct a comprehensive study for SFTSV escape from autophagy, clarify how the virus control key factors of FRCs autophagy to facilitate its proliferation, and confirm the lethal molecular of key nodes. We believe this study is of great significance not only for SFTSV, but also for other hemorrhagic fever viruses in the pathogenesis, the development of targeted drugs and the prevention and control of the disease.

发热伴血小板减少综合征（SFTS）是我国发现的重要蜱传传染病，病原体为SFTSV。该病分布广泛，病死率高，致病机理不明。申请人及其他科学家研究均发现SFTSV致死性感染的靶细胞主要是脾脏网状纤维细胞（FRCs），表明FRCs的感染是致死主要原因，而自噬是宿主抵御外来微生物最早出现的降解反应。项目组基于前期SFTSV逃逸宿主I型干扰素、Rab5与NSs诱导的“胞质样结构”共定位、SFTSV与FRCs-LC3共定位等研究，认为SFTSV与FRCs自噬过程的全面理解有助于揭示病毒逃逸和致死机制。本项目将用已建立的FRCs系，通过基因工程、蛋白质学和共聚焦显微技术等，从自噬经典途径、替代途径及Rab蛋白对SFTSV逃逸FRCs自噬进行全面研究，阐明病毒如何调控FRCs自噬关键因子以利于其增殖，确认致死关键节点分子。该研究对SFTSV及类似的出血热病毒致病机理、靶向药物的研制及疾病防控有着重大意义。

新布尼亚病毒目前的致病机制尚不明确，越来越多的研究表明大多数病毒已经进化出种策略来对抗或者利用自噬促进病毒生长与复制。本研究旨在靶细胞FRCs中，阐明SFTSV与灭活的SFTSV对自噬的作用，探究NSs与NP蛋白通过ERK1/2-mTOR信号通路如何调控自噬。SFTSV与热灭活的SFTSV感染FRCs细胞后，通过WB、RT-qPCR和免疫荧光检测自噬相关指标LC3、Rab5、Beclin1和LAMP1。SFTSV感染与病毒蛋白NSs/NP转染FRCs细胞后，通过共聚焦显微镜检测SFTSV感染细胞和NSs/NP转染细胞后引发的自噬流以及SFTSV和NP与LC3的共定位情况。病毒蛋白NSs/NP转染FRCs后，对自噬涉及的ERK1/2-mTOR信号通路进行探讨，检测ERK1/2与mTOR信号通路的磷酸化水平，并在加入ERK1/2抑制剂U0126后检测自噬指标的表达水平。最后综合分析SFTSV与自噬的作用机制。本研究发现WB检测SFTSV与灭活的SFTSV感染FRCs细胞后自噬指标LC3、Rab5、Beclin1和LAMP1蛋白表达水平增加，同时RNA水平和免疫荧光结果中自噬指标水平增加，说明SFTSV与灭活的SFTSV诱导自噬，且SFTSV诱导的自噬不依赖于病毒复制。SFTSV感染FRCs后在不同时间点与LC3存在共定位，并能诱导自噬通量的增加。进一步研究表明质粒表达的NP蛋白转染FRCs后与LC3共定位，NSs/NP表达蛋白促进自噬通量的增加，并通过激活磷酸化的ERK1/2抑制磷酸化mTOR诱导自噬。研究结果表明SFTSV和热灭活的诱导自噬水平增加，SFTSV的NSs和NP蛋白通过调控ERK1/2-mTOR信号通路，从而促进自噬。这些发现为SFTSV发病机制的研究和抗病毒药物的开发提供了新的思路。