我国新分离斑点热立克次体主要表面蛋白对THP-1细胞专嗜性的致病机制研究

Spotted fever group (SFG) rickettsiae are transmitted by the bite of ticks and mites and cause severe diseases in humans. We have isolated a strain of SFG rickettsiae from the blood of a patient with unknown infectious disease from Anhui Province (tentatively called new SFG rickettsia), which differs from the known rickettsiae genetically and antigenically. The unique future of the new rickettsia is that it can grow in mononuclear cell, which make it easier to spread in the body and increasing its virulence. This proposal intends ①to get the whole genome sequencing of the new rickettsia using the second-generation sequencing and to find surface proteins which have amino acid mutation compared to other SFG rickettsiae; ② to express OmpB and other surface proteins using molecular cloning method and to determine receptors of the new rickettsia on the mononuclear cells using immunoprecipitation assay; ③to determine the mechanism of rickettsial escaping phagosome by confocal microscope using the Fab fragments of anti-rickettsial surface protein antibody. ④ to identify the serum-reactive proteins by protein microarray and Find out the new rickettsia diagnostic antigens. ⑤to immune animals with recombinant protein and evaluate immune protection to the new rickettsia with quantitative polymerase chain reaction (PCR) . The significance of this proposal is to explore the pathogenesis of Rickettsia and to identify the mechanism to intervene rickettsial infection, which are very important for disease prevention, protection of people’s health and prevention of bioterrorism.

斑点热立克次体由蜱螨叮咬传播，引起人类严重疾病。我们从安徽不明原因发热病人血液中分离到一株斑点热立克次体（暂称新立克次体），其基因型和生物学特性不同于已知立克次体；其只在单核细胞生长，提示易随单核细胞体内扩散。本项目拟①用二代测序法获得新立克次体全基因组序列，结合表面蛋白质谱分析，找出新立克次体氨基酸有变异或新的表面蛋白；②用基因克隆方法表达OmpB和其它变异或新的表面蛋白，将重组蛋白与单核细胞蛋白做免疫共沉淀，揭示新立克次体在单核细胞的受体。③用等聚焦显微镜观察抗新立克次体表面蛋白Fab片段抗体和新立克次体逃逸单核细胞吞噬体，阐明立克次体逃逸吞噬体的机制。④用蛋白芯片技术筛选主要血清反应性蛋白，找出新立克次体的诊断抗原。⑤将重组蛋白免疫动物，用定量PCR方法评价其对新立克次体的免疫保护性。阐明表面蛋白在致病过程中的不同作用，为干预立克次体感染靶点、诊断性抗原及疫苗研究提供理论支持。

斑点热立克次体为专性细胞内寄生菌，传染源为野生啮齿动物，传播媒介为蜱或螨，人因被带菌的蜱、螨叮咬而得病，该病广泛分布于世界各国，致病的主要原因是菌体表面的暴露蛋白（以下称表面蛋白）能特异性吸附、入侵易感宿主细胞，并抵御细胞自身的防御机制进而在细胞内生存、繁殖、扩散、感染新的正常细胞、释放毒性产物引起一系列临床表现，造成人类疾病。本课题主要通过对我国新发现的日本斑点热立克次体分离株表面蛋白的序列分析结合表面蛋白质谱分析，找出在氨基酸有变异的表面蛋白活性蛋白以及毒素蛋白，构建相应的蛋白表达质粒，研究立克次体逃逸宿主细胞初步机制，找出主要的血清反应性蛋白，建立用于表面蛋白免疫保护性实验的日本斑点热立克次体分离株感染动物模型。.结合斑点热立克次体分离株序列和表面蛋白分析，发现主要表面蛋白OmpB基因翻译的氨基酸有连续的5个氨基酸缺失和4个不同位点氨基酸的变异，同时还发现分离株存在YbgF 和 PrsA两种新的表面蛋白。构建并表达的OmpB抗原具有良好地特异性和敏感性，制备了5株高效价OmpB单克隆抗体，建立了斑点热立克次体抗体ELISA检测方法和斑点热立克次体核酸的荧光定量PCR检测方法，建立了适用于表面蛋白免疫保护性实验的动物模型，获得了斑点热立克次体在小鼠体内繁殖趋势、血液学变化趋势、细胞因子、组织病理等有价值的结果，同时首次发现了斑点热立克次体VapB-VapC毒素-抗毒素系统相互作用方式完全不同于之前在结核分枝杆菌等自生细菌中的毒素抗毒素系统的相互作用方式，及其在细胞凋亡中的关键作用。.通过此项目研究，我们建立的核酸核抗体检测方法可应用到临床转化，建立的表面蛋白保护性动物模型可用于疫苗研究以及致病机制研究，VapB-VapC在宿主细胞中的致凋亡作用以及全新的毒素-抗毒素蛋白相互作用机制为后续系统性的研究斑点热立克次体毒素-抗毒素系统在致病机制中的作用奠定坚实基础。