新的毒力分子UGPase在布鲁氏菌毒力、宿主免疫反应及免疫保护中的作用研究

The UTP-glucose-1-phosphate-uridylyltransferase（UGPase）affects directly the bacterial virulence because it participates in the synthesis of Escherichia coli(E.coli) lipopolysaccharide and Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide. The results had demonstrated that the Brucella UPGase was expressed differently between Brucella melitensis virulent strain and vaccine strain in my previously research on B.melitensis comparative proteomics，and the UGPase molecular loss directly affects Brucella lipopolysaccharide content and bacterial immune response. So, I presumed that the UPGase may be a novel Brucella virulent element . However, it is still unknown how UPGase to play a role in the process of Brucella virulence and immune response . In this study, the B.melitensis UGPase gene deletion strain(BM△UGPase) will be constructed and the change of the bacterial phenotype and virulence, bacterial outer membrane components, the immune response after infecting macrophage and intracellular replication and traffic will all be analyzed comparatively, which will provide the scientific datas for the characterization of UGPase as an essential virulence factor of Brucella melitensis and the role of UGPase in Brucella virulence and host immune response. And the immunoprotection of BM△UGPase will be evaluated. The BM△UGPase may become a new rough vaccine strain for brucellosis prevention. ..

尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿甙酰基转移酶（UGPase）因参与大肠杆菌脂多糖和肺炎链球菌荚膜多糖的合成而直接影响细菌的毒力，在申请者先前的比较蛋白质组学研究中也发现该分子在布鲁氏菌强弱毒株间存在着表达差异，并且该分子缺失直接影响布鲁氏菌脂多糖的含量和细菌的免疫反应，为此推测该分子是布鲁氏菌新的毒力分子，但其在布鲁氏菌毒力和免疫反应过程中如何发挥作用的还不清楚。为此，本研究预期开展构建羊布鲁氏菌UPGase缺失株BM△UGPase，比较分析该基因缺失后细菌毒力表型的变化、细菌外膜组分的差异、细菌感染细胞后免疫反应的变化及细菌在胞内复制运输的改变等实验研究来鉴定UGPase是布鲁氏菌有效的毒力因子并阐明其在影响布鲁氏菌毒力和宿主免疫反应中所发挥的重要作用，本研究还将对该缺失株进行免疫保护力评价，其可能为动物布鲁氏菌病提供新的粗糙型疫苗候选株。

UGPase能够可逆地催化glucose-1-phophate 和UTP合成UDP-glucose。UDP-glucose是细菌表面糖蛋白，聚糖，半乳糖以及糖化合物合成的重要成分，Ugpase对保持细菌结构和毒力作用起到了重要的作用。.本研究通过开展构建布鲁氏菌Ugpase缺失株，比较分析缺失株与毒力株在细菌生长特性，表面LPS反应原性，宿主细胞内生存，小鼠体内毒力作用等形态学和毒力学的研究内容，分析Ugpase缺失后引起细菌毒力和表型的改变。为了进一步揭示Ugpase导致细菌毒力和表型改变的分子机制，我们又通过开展了缺失株与毒力株全菌蛋白的比较分析，以及毒力株感染宿主细胞引起的宿主细胞全蛋白以及泛素化，乙酰化和琥珀酰化修饰蛋白的差异表达分析，进而揭示布鲁氏菌Ugpase的分子毒力作用机制。同时我们又构建了布鲁氏菌缺失株BMΔUGPase菌壳疫苗，并对其免疫原性和攻毒保护进行了研究。结果显示UGPase是布鲁氏菌新的毒力分子，其缺失后细菌毒力降低，生长速度减慢，影响LPS的反应原性，侵染宿主细胞和感染小鼠的能力以及刺激淋巴细胞活化和细胞因子分泌的能力均减弱。进一步研究发现缺失Ugpase后导致布鲁氏菌菌内ABC转运体，IV型分泌系统，醌信号系统以及表面阳离子耐药等代谢途径中的大量蛋白质表达量下降，这是布鲁氏菌Ugpase缺失后导致细菌毒力下降的根本原因。然而通过感染宿主细胞后蛋白质组学数据分析显示Ugpase缺失后细胞内与免疫和生存相关的分子开始活化，促进了细胞因子的分泌和一些重要信号系统的活化，增强了细胞代谢和呼吸能力，引起一些泛素化，乙酰化和琥珀酰化修饰蛋白表达差异。这一步说明Ugpase缺失，由于细菌毒力降低导致了细胞内多个系统和功能发生了改变，尤其是参与细胞骨架，内质网蛋白质加工处理，参与病原识别和免疫逃逸，糖代谢，碳代谢以及氨基酸代谢相关的蛋白质均发生了明显的变化。这一研究为揭示布鲁氏菌Ugpase的毒力作用提供了科学依据，同时为进一步研究布鲁氏菌胞内生存和免疫逃逸等重要治病过程的分子机制提供了新思路，为筛选鉴定新的诊断标识，疫苗候选抗原以及药物靶点提供技术保障。