布鲁氏菌毒力蛋白Btp1/TcpB抑制宿主天然免疫信号通路的机制研究

Brucella has evolved a stealthy strategy to escape or inhibit recognition of the innate immunity in the host. TcpB/Btp1 is the only identified virulence factors to inhibit host innate immune responses by now, and it impairs the host TLR signaling pathway, but its targets and the mechanisms remain to be certain. Here, using Protein-Protein Interaction technology, RNA interference etc, we want to determine the target of TcpB/Btp1 in the five canidates, then unveil the functions of their interaction and effects on target protein phosphorylation and ubiqutination. Based on the acquired T4SS mutant, we study the dependence of TcpB/Btp1 secretion on T4SS and roles of the association between TcpB/Btp1 and target on bacterial intracellular survival and cellular functions. Finally, in animal experiments, we explore the contribution of interactions between TcpB/Btp1 and target to Brucella virulence in vivo. In conclusion, this study will illustrate mechanisms and functions of TcpB/Btp1 acting on TLR signaling pathway at a molecular, cellular and in vivo level, which would be helpful to clarify molecular mechanisms of how Brucella impair host immune response.

布鲁氏菌能够通过逃避、抑制等方式破坏宿主的免疫反应，TcpB/Btp1是布鲁氏菌中目前发现的唯一可以抑制宿主天然免疫反应的毒力因子，它能够破坏宿主的天然免疫信号通路，但分子靶标和作用机制尚不明确。在本研究中，我们拟采用蛋白-蛋白相互作用、RNAi等技术确定与TcpB/Btp1相互作用的靶标分子，然后阐明TcpB/Btp1与靶蛋白的相互作用的功能及对靶蛋白磷酸化、泛素化的影响。在已经获得T4SS突变株的基础上，研究细胞感染时TcpB/Btp1的分泌对T4SS的依赖性，及与靶分子的相互作用对细菌胞内生存和破坏细胞功能的影响。最后，通过小鼠攻毒试验揭示TcpB/Btp1与靶分子的相互作用对小鼠致病性的影响。总之，本研究力图在分子、细胞和机体三个水平研究TcpB/Btp1作用于宿主TLR信号通路的机制和功能，阐明布鲁氏菌抑制宿主免疫反应的分子机理。

布鲁氏菌能够通过逃避、抑制等方式破坏宿主的免疫反应，TcpB/Btp1是布鲁氏菌中目前发现的唯一可以抑制宿主天然免疫反应的毒力因子，它能够破坏宿主的天然免疫信号通路，但分子靶标和作用机制尚不明确。本项目在分子、细胞和机体三个水平研究TcpB/Btp1作用于宿主TLR信号通路的机制和功能，确定与TcpB/Btp1存在相互作用的分子靶标为MAL，发现了TcpB通过促进MAL的降解，破坏了 NF-kappaB信号通路，阐明了布鲁氏菌通过TcpB/Btp1抑制宿主免疫反应的分子机制。通过构建Brucella TcpB/Btp1突变株，我们发现，它的生长曲线没有发生变化，在小鼠体内的生存能力减弱，且导致小鼠脾脏炎症反应增强，这说明TcpB具有抑制小鼠体内反应的功能。采用报告基因和WB检测I-κB分析TcpB对细胞NF-κB 通路的影响，我们发现，它能够特异性抑制MAL介导的对细胞NF-κB 通路活化，并且这种抑制作用具有浓度依赖性。采用免疫共沉淀分析TcpB与所有含有TIR结构域的宿主接头蛋白的相互作用发现，TcpB能够特异性与MAL蛋白结合，而不与其它四个结构的蛋白结合（包括MyD88、TRIF、TRAM和SARM）。我们根据TcpB的结构域特点，构建了它的截短体和点突变体，并分析它们与MAL之间的相互作用，结果发现其C端结构域介导了与MAL之间的结合。鉴于其C端结构域在细胞定位及与MAL蛋白结合的重要性，我们分析了TcpB不同结构域对其抑制NF-κB信号通路活化方面的重要性，结果发现C端结构域能够抑制NF-κB 信号通路。最后，我们采用RNAi分析了TcpB及MAL对布鲁氏菌胞内生存的影响，结果表明，TcpB与MAL相互作用对布鲁氏菌的胞内慢性生存十分重要。将野生株或TcpB敲除株感染细胞，同时采用TB-8或TB-9处理细胞，采用ELISA检测上清中TNF-α和IFN-β的含量，分析TB-8和TB-9抑制细菌引起的天然免疫反应。将TcpB敲除株感染细胞，同时采用TB-8或TB-9处理细胞，分析TcpB敲除株在胞内的生存能力，发现TB-8或TB-9均能够对敲除株的毒力具有一定的回补作用。最后，在对布鲁氏菌胞内生存深刻理解的基础上，我们提出了布鲁氏菌胞内生存过程中的主要步骤，指出了四型分泌系统效应蛋白TcpB在这个过程中的关键作用。