ccpA在2型猪链球菌毒力及免疫调节中作用的研究

2型猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌，该菌所导致的2型猪链球菌病严重影响养猪业的发展并威胁人类的健康。本课题利用我们通过免疫蛋白质组学方法筛选的、对2型猪链球菌毒力及免疫应答具有调节作用的ccpA蛋白（catabolite control protein A，ccpA)进行分析，通过构建ccpA基因缺失菌株及互补菌株，应用蛋白质组学方法探索其对细胞壁相关蛋白的影响，并鉴定其对细胞黏附、溶血活性、糖代谢途径及生化特性的影响，进而通过动物模型研究其在毒力变化、机体免疫应答、TLRs信号通路及NF-κB和MAPK信号通路中发挥的调节作用，期望为相关重要调控因子对2型猪链球菌毒力、免疫调控机制及疾病的发生机制的研究方面鉴定基础。

2型猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌。ccpA是一种重要的碳调控蛋白，在2型链球菌的代谢调节过程中具有重要的调节作用。本实验基于同源重组的原理，采用抗性筛选方法，建立了具有壮观霉素的猪链球菌2型突变菌株，该菌株可使S.suis 2毒力降低，采用LC-Q/TOF-MS方法对突变菌株进行了代谢产物全谱分析结果来看，突变菌株同原菌株代谢产生的代谢产物存在差异，差异代谢物质主要涉及氨基酸代谢、核酸代谢以及脂肪代谢，并且还有一些小分子有机酸等。基于iTRAQ LC-MS/MS的蛋白质组学方法对s.suis2 ccpA功能进行研究，并通过进行了Gene Ontology和KEGG分析，质谱鉴定的蛋白质共计1,167个，其中差异表达蛋白质数目55个。对所有差异蛋白的比对序列所关联的GO功能条目共提取到与其中45个差异蛋白序列相关的269条GO功能条目。在功能注释过程中，共37条差异蛋白序列被87条GO功能条目注释。本实验还提取到与21个差异蛋白序相关的34条KEGG信号/代谢通路。高通量基因表达谱测序技术分析发现ccpA基因对2型猪链球菌毒力、碳代谢、免疫调节等基因的表达调控过程具有一定调节作用。GO分析和KEGG分析表明该基因对2型猪链球菌的调节涉及到细菌代谢等多个生物学过程。结合转录组、代谢组学数据进行分析发现：在ccpA基因的影响下，代谢产物的变化可能与相应基因的表达变化相关，在一定程度上影响了碳代谢的过程。经过原核表达S.suis2的ccpA蛋白并进行纯化，通过Westbolt鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。并经ccpA原核表达蛋白对巨噬细胞RAW264.7进行刺激发现，ccpA蛋白可调节巨噬细胞NO产生，另外ccpA原核表达蛋白可通过对iNOS、NF-κB、p38和ERK1/2、MAPK等的调节从而影响巨噬细胞RAW264.7对细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌。根据文献可知，ccpA在s.suis2毒力调节过程中具有重要的作用，通过进行小鼠的攻毒试验后发现，ccpA影响小鼠IL-1、TNF-α和IFN-γ的分泌，并能够引起TLR-1到TLR-9、NF-κB的mRNA水平表达的变化。同时该基因可以导致小鼠脾指数的变化，并在一定程度上影响小鼠脾T淋巴细胞亚群。故可推论出ccpA基因通过TLRs/NF-κB在S.suis2感染免疫调节通路中具有重要的调节作用。