具有靶向性和pH敏感双功能基因载体的构建及转染性能研究

To overcome the defects of low transfection efficiency and poor specificity of non-viral gene carriers, this project constructs pH-sensitive gene vectors with cell recognition and intracellular release function, basing on the acid sensitivity and biotinylated targeting of orthoester. By the biotin targeting ligand modification, a series of pH-sensitive polymers are prepared from diamino ortho ester as monomer. The prepared polymer, serving as gene vector, mediates indicating DNA to transfect different cells. The relationship between transfection efficiency and the polymer carrier structure, weak acid responsivity, the carrier/composite escape rate in endosomes, release rate of DNA and biological targeting ligand is investigated systematically. The cytotoxicity, transfection efficiency and transport mechanisms are clarified. Through this project, a novel gene transfer system with highly efficiency, low toxicity and good stability is developed, providing theoretical basis for the gene therapy.

针对非病毒基因载体转染效率低和无特异性的问题，本项目基于原酸酯的酸敏感性质和生物素靶向性的优点，构建具有细胞识别和胞内释放功能的pH敏感型基因载体。以二元氨原酸酯为单体、生物素靶向配体修饰，制备一系列pH敏感高聚物。以该高聚物为基因载体，介导不同指示DNA（编码绿色荧光蛋白的质粒pEGFP、编码荧光素酶的质粒pCMV-Luc）转染不同的细胞（小鼠成纤维细胞系NIH 3T3、人肝癌细胞系HepG2、人胶质瘤细胞系U251）。阐述该类高分子在转染过程中的细胞毒性、转染效率、转运机制，系统研究聚合物载体的结构、微酸响应度、载体/复合物在内涵体内逃逸速率、DNA在细胞液内释放速率与载体/复合物的转染效率之间的关系，探讨生物靶向配体对转染效率的影响。通过本项目研究，可开发一类高效、低毒、稳定的基因传递体系，为基因载体的研究提供理论基础和新途径。

本项目基于原酸酯的酸敏感性质，构建具有pH敏感和靶向性的聚原酸酯阳离子聚合物和透明质酸-原酸酯两亲性聚合物。首先，以原酸酯为结构中心，设计二元胺原酸酯、双丙烯酸原酸酯等单体化合物库；经自由基开环聚合或Michael加成聚合反应，制备出相应地聚原酸酯嵌段共聚物。以聚原酸酯阳离子聚合物为载体，以编码绿色荧光蛋白的质粒pEGFP为介导DNA，转染不同的细胞（小鼠成纤维细胞系NIH 3T3、人肝癌细胞系HepG2）。阐述该类高分子在转染过程中的细胞毒性、转染效率、转运机制，系统研究聚合物载体的结构、微酸响应度、载体/复合物在内涵体内逃逸速率、DNA在细胞液内释放速率与载体/复合物的转染效率之间的关系。其次，基于透明质酸的特异靶向性，以原酸酯为结构单元，构建透明质酸-原酸酯（HA-OE）两亲型接枝聚合物。采用超声法制备得到聚合物胶束，用纳米粒度仪分析HA-OE与透明质酸-十八烷胺（HA-C18）的粒径大小与分布，并研究影响粒径大小以及粒径分布的原因。选取阿霉素（DOX）作为模型药物，考察在不同pH下载药胶束的体外释放行为，结果表明，带有pH敏感基团的HA-OE胶束相比较于HA-C18具有更好的靶向性和缓释特性。选取人乳腺癌细胞（MCF-7）为细胞模型，考察聚合物胶束的细胞毒性.通过荧光显微镜观察DOX-HA-C18、DOX-HA-OE和游离DOX的细胞摄取情况，并探讨两种聚合物胶束的释放性能和细胞摄取机制。综上所述，原酸酯结构单元具有良好pH敏感特性和良好的生物相容性，为原酸酯基聚合物应用与开发提供了坚实的理论基础，有望开发一类高效、靶向性强、低毒、稳定的药物载体材料。