黄芪对肺癌微环境中BMSCs肿瘤相关蛋白表达的影响及表观遗传机制研究

BMSCs已成为肺癌等肿瘤细胞学治疗的最佳干细胞之一，但因其在肿瘤环境中可向恶性转化，其安全问题日渐突出。研究肺癌微环境中BMSCs恶性转化的机制并筛选可预防其恶变的药物日益受到重视。表观遗传原理与技术已成为探讨肿瘤发生机制及筛选防治肿瘤中药有效部位的重要途径之一。.本课题拟提取甘肃道地中药黄芪皂苷、黄酮、多糖等提取物，应用Transwell建立BMSCs-肺癌细胞株共培养体系，研究黄芪提取物对肺癌微环境诱导下BMSCs细胞形态学、生长周期、染色体核型变化、CEA等肺癌相关蛋白的表达水平，以及对p16等肺癌相关基因甲基化、组蛋白乙酰化、关键基因转录水平等的影响；统计分析BMSCs表观遗传变化与关键基因转录、癌相关蛋白表达水平的相关性及黄芪提取物的调控作用。以揭示BMSCs恶性转化的能力及其机制，并筛选出可预防其恶性转化的黄芪有效部位，为黄芪联合BMSCs安全有效地临床应用奠定基础。

目的：通过建立肺腺癌与骨髓MSCs共培养体系，研究肿瘤微环境下MSCs细胞形态学、增殖、凋亡及相关肿瘤蛋白表达的变化；分析各组BMSCs表观遗传学变化；并筛选出可预防BMSCs恶性转化的黄芪有效部位，并揭示其预防肿瘤的调控机制。.方法 ：检测黄芪多糖（APS）、皂苷对MSCs、A549细胞的体外增殖的影响，筛选出黄芪发挥作用的有效部位及浓度；利用Transwell小室建立MSCs和A549细胞的共培养体系，观察各组细胞的形态、平板集落形成实验检测细胞的增殖能力、FCM检测细胞周期；利用激光共聚焦分析MSCs细胞骨架变化；以常规染色和G显带进行染色体的核型分析；基因芯片分析相关信号通路及表观遗传学相关分子变化；采用Western blot技术检测抑癌基因p53、原癌基因Ras及ERK信号传导通路蛋白p-ERK、NF-κB、Capase-3蛋白的表达变化以及BMSCs组蛋白去乙酰化酶（HDAC）及H3K9、H4K5、H4K8等乙酰化修饰位点的变化，分析黄芪对上述指标的影响。.结果与结论：肺腺癌微环境中培养的MSCs细胞出现类A549样形态改变，异常增殖，这可能与ERK1/2信号传导通路异常，抑制细胞凋亡、过度增殖有关。50 μg /ml APS促MSCs增殖抑制A549效果最显著，确定以此进行后续研究。APS可抑制MSCs在肺腺癌微环境中的异常增殖，可能与APS调控ERK1/2信号通路有关；MSCs抑癌基因p16及p53的表达受抑，在一定程度上促进了MSCs恶性转化的趋势；APS干预对p16基因的表达提升作用明显，可能是APS的抑癌机制之一；MSCs中肿瘤相关的信号通路Wnt、RAS中的关键分子表达量发生异常，APS对该异常活动具有一定的回复效果。基因芯片数据聚类分析，黄芪干预组可预防共培养MSCs向类肿瘤样细胞分化；表观遗传学研究，肺癌微环境共培养的MSCs通过调节自身HDAC活性的升高，引起自身H3K9及H4K8乙酰化水平降低，影响下游基因的表达，可导致MSCs向着A549方向分化。但APS未使H3K9、H4K5、H4K8的乙酰化水平得到回复，可能APS不是通过影响H3K9等的乙酰化而调控肺癌微环境共培养体系中MSCs的异常分化，具体机制有待进一步深入研究。本项目的实施为MSCs临床应用的安全性问题及推动中医药与MSCs的联合应用提供了重要参考依据。