黄芪多糖对甲醛环境中BM-MSCs遗传毒性的影响及机制研究

Formaldehyde (FA) is a known human carcinogen (group A1) that causes leukemia, however, the mechanisms remain unclear. Several studies have confirmed that can reach and exert a toxic effect on hematopoietic stem cells. However, to date, the ability of FA exposure to disrupt BM-MSCs has not been reported. As one component of bone marrow, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) are notable for their multi-differentiation potential. Also, BM-MSCs can help hematopoietic stem cells maintain function and primary properties. Thus, if formaldehyde induces cytotoxic and genotoxicity in BM-MSCs, BM-MSCs will lose their normal control over hematopoietic stem cells, leading to myeloid leukemia. Our previous study has confirmed that the formaldehyde induce cytotoxic in BM-MSCs and make it block in G2, but astragalus polysaccharides can promote proliferation activity of BM-MSCs environmented in formaldehyde. The present study was performed to detect the genotoxic effect of formaldehyde on mouse BM-MSCs, and try to elucidate the molecular mechanism, thus provides the biological evidence for the formaldehyde to lead to leukemia, also for the application of the authentic Chinese herbal medicine in gansu--astragalus membranaceus prevention and treatment of leukemia.

甲醛是A1类致癌物质，可以导致白血病的发生，但是生物学证据不足。BM-MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还能调节造血干细胞的正常增殖和分化。因此，BM-MSCs性状改变，就会影响骨髓的正常造血，从而可能导致白血病的发生。我们前期研究已证实甲醛对BM-MSCs具有细胞毒性，能够抑制BM-MSCs的增殖，并使其阻滞在G2期，而黄芪多糖能够促进甲醛环境中BM-MSCs的增殖活性。本实验在前期研究基础上采用彗星、KCl-SDS沉淀、姐妹染色单体互换、微核实验深入研究甲醛对BM-MSCs的遗传毒性效应；并用黄芪多糖进行干预，通过RT-PCR 和Western blot技术检测核苷酸切除修复相关基因XPA、XPC和ERCC1 mRNA和蛋白的表达情况，阐述黄芪多糖可能的作用机制，从而为甲醛导致白血病的发生提供生物学依据，也为甘肃道地中药材——黄芪防治白血病的应用提供科学基础。

为了研究甲醛对BM-MSCs的毒性作用及黄芪多糖的保护作用和潜在的机制，本实验体外培养人BM-MSCs，利用MTT法检测细胞增殖活性，彗星实验检测DNA断裂，KCl-SDS沉淀实验检测DNA-蛋白交联（DNA-protein crosslinks，DPCs），姐妹染色单体互换实验（Sister chromatid exchange, SCE）检测姐妹染色单体互换，微核实验（Micronucleus, MN）检测微核形成情况，深入研究甲醛对BM-MSCs的遗传毒性效应；并用黄芪多糖进行干预，通过基因转录组测序对甲醛染毒和黄芪多糖干预后的基因表达变化进行生物信息学分析，通过功能富集分析(Go-analysis)和信号转导通路富集分析(Pathway-analysis)，最终发现差异表达基因的生物功能和可能参与的生物信号通路，并通过RT-PCR 和Western blot技术检测DNA损伤修复相关基因RPA1、RPA2、PCNA、XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG和ERCC1 mRNA和蛋白的表达情况。研究发现，90~150μmol/L甲醛作用24 h均能明显抑制人BM-MSCs细胞增殖活性，引起细胞DNA链断裂、DPCs、微核及SCE形成，说明甲醛能够对人BM-MSCs产生遗传毒性。黄芪多糖高剂量（400μg/mL）、中剂量（100μg/mL）、低剂量（40μg/mL）均能增强甲醛染毒人BM-MSCs的增殖活性，能够明显减少细胞DNA链断裂、DPCs、微核及SCE形成，尤其是黄芪多糖中剂量效果最为明显。通过基因转录组测序结果分析，甲醛染毒以及黄芪多糖干预后差异表达的基因富集于细胞外基质受体相互作用和DNA的损伤修复。RT-qPCR和Western Blot检测发现黄芪多糖干预后PCNA、RPA1、RPA2、XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG和ERCC1 mRNA和蛋白表达均升高。这些实验结果表明甲醛能够对人BM-MSCs产生遗传毒性，有望为研究甲醛导致白血病的发生提供生物学依据。也证实了黄芪多糖能够保护甲醛环境中的人BM-MSCs，减少遗传毒性发生，其机制可能与与上调PCNA、RPA1、RPA2、XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG和ERCC1基因表达，促进DNA损伤修复有关。