肝癌微环境中肿瘤相关巨噬细胞外分泌蛋白的差异表达及其功能研究

Primary Hepatocellular Carcinoma is a malignant tumor with high incidence in Guangxi province. The morbidity of hepatocellular carcinoma is different in individuals with the same exposure. Our previous studies indicated that this different incidence may dependent on the geographic regions and ethnic difference and tumor microenvironment may play a critical role in the development of HCC. Tumor associated macrophages (TAMs) are main component In tumor microenvironment. In this project, We plan to culture TAM1 and TAM2 in vitro by induction , build three-dimensional co-culture system of TAMs with hepatoma cells and normal liver cells, screen differentially expressed proteins by comparative analysis of protein molecules using iTRAQ and mass spectrometry combined with quantitative proteomics technology, then validate the differential proteins expression and analysis the functions of differentially expressed proteins in malignant tumor growth, metastasis, tumor immunity in cell signaling in this project, which will help us to explore the potential impact of proteins secretion changes of TAMs on hepatocarcinogenisis and invasiveness in hepatic microenvironment and search new molecular markers for liver cancer invasion and provide theoretical evidence for the treatment of metastatic HCC by TAMs targeting therapy.

原发性肝细胞癌是广西高发的恶性肿瘤。不同个体在同样的暴露环境，其肝癌发病率存在差异。本课题的前期研究提示，肝癌发生发展存在地域和种群差异与体内肿瘤微环境密切相关。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中的主要成员。本项目拟通过诱导培养出TAM1和TAM2，建立两者与肝癌细胞或正常肝细胞的三维立体共培养体系，运用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术，分析TAM1和TAM2的外分泌蛋白组与TAMs和肝癌细胞相互诱导的蛋白质分子, 用临床标本对其中差异蛋白质分子进行表达验证，研究肝癌微环境中TAM1、TAM2外分泌蛋白对肝癌细胞生长和侵袭能力的影响，以期发现肝癌发生发展中新的分子标志物，为肝癌的早期诊断和靶向治疗提供理论基础和实验依据。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤，死亡率居所有恶性肿瘤死亡率的第二位。肝癌的复发转移是导致其死亡率高居不下的主要原因，因此揭示肝癌转移的相关分子机制已经成为提高肝癌临床治疗效果和延长肝癌患者寿命的关键。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）是指肿瘤发生发展的局部病理环境。肿瘤的发生发展和复发转移不仅仅由恶性肿瘤细胞自身决定，而且与肿瘤微环境中非肿瘤细胞成分密切相关，肿瘤微环境已经成为癌症基础研究领域的热点。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）是肿瘤微环境中众多炎症细胞的主要成员，约占炎症细胞总数的30％～50％。肿瘤微环境中浸润的高密度TAM主要是M2型肿瘤相关巨噬细胞。本研究中，我们在体外诱导培养M2型肿瘤相关巨噬细胞的基础上，采用BioLevitator™ 三维细胞培养仪模拟体内肿瘤微环境在体外建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞的立体共培养体系；运用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术，建立M2型肿瘤相关巨噬细胞与肝癌细胞立体共培养体系外分泌蛋白质的差异表达谱；基于生物信息学分析技术结合文献报道筛选其中的关键差异蛋白质分子，明确其对肝癌转移功能的影响，并进一步采用RT-PCR、Western blot等技术深入探讨其促进肝癌转移的分子机制。研究结果表明：①我们在体外成功诱导并建立了Ml和M2两种极化的巨噬细胞模型；②M2型肿瘤相关巨噬细胞主要通过诱导肝癌细胞发生EMT增强肝癌细胞侵袭和转移的潜能；③我们应用BioLevitator™ 三维细胞培养仪模拟体内肿瘤微环境在体外建立了M2、SMMC7721以及M2+SMMC7721的三种立体培养体系，并运用iTRAQ与质谱相结合的定量蛋白质组学技术，建立了三种立体培养体系外分泌蛋白质的差异表达谱，其中IL-1β是M2型肿瘤相关巨噬细胞与SMMC7721细胞共培养相互诱导产生的关键差异蛋白质分子，与肿瘤转移密切相关；④IL-1β主要通过参与调节NF-κB/Snail信号通路影响肝癌细胞的EMT进程，最终发挥其促进肝癌细胞转移潜能的功能，IL-1β是肝癌转移的潜在治疗靶点。本研究旨在从蛋白质组学的角度阐明M2型肿瘤相关巨噬细胞促进肝癌转移的分子机制，为今后肝癌转移的靶向治疗提供新思路。