携带Bcl-2基因的神经干细胞耳蜗内移植在乌本苷损伤大鼠模型耳蜗中的应用

成年哺乳动物耳蜗听感觉上皮及神经组织在受到严重损伤后不能自我再生和修复,细胞移植或内耳基因治疗为感音神经性耳聋的治疗提供了新思路。我们前期在离体及在体研究中发现低浓度的乌本苷仅仅选择性损伤耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维；而高浓度的乌本苷同时也造成耳蜗毛细胞的损伤。细胞凋亡是毛细胞和螺旋神经节细胞死亡的主要破坏方式。在此基础上，我们首先构建携带抗凋亡基因BCL-2的重组腺病毒（Ad-EGFP/BCL-2）并检测其对离体培养的乌本苷处理的耳蜗器官保护作用，再利用神经干细胞多潜能分化的特性及作为基因治疗载体所具有的优点，将高效表达Ad-EGFP/BCL-2的神经干细胞克隆移植到不同浓度乌本苷处理的大鼠耳蜗内，同单独应用干细胞或Ad-EGFP/BCL-2耳蜗内注射进行比较，了解不同方法对不同损伤模式的耳蜗器官的保护作用及耳蜗微环境的变化与神经干细胞存活分化的关系，为感音神经性耳聋的治疗提供实验依据。

本项目严格按照课题的实验计划和研究内容进行，完成了大部分实验的研究任务。目前已发表SCI收录论文共四篇，培养硕士研究生两名。.　第一：我们发现乌本苷体外损伤大鼠耳蜗器官的模式是时间和剂量依赖型。低浓度的乌本苷主要损伤螺旋神经节细胞，而高浓度的乌本苷既损伤螺旋神经节细胞又损伤毛细胞，损伤程度从底回到顶回逐渐减轻，细胞的死亡是由凋亡诱发的。. 第二：我们成功制备了乌本苷耳中毒大鼠模型，其损伤模式也是时间和剂量依赖型。低浓度乌本苷组动物ABR阈值仅在高频区出现提高，并且其DPOAE振幅无明显改变；而高浓度组组，动物的ABR阈值及DPOAE振幅均在各个频率出现明显改变。组织学检测结果和电生理的改变也相吻合，并且耳蜗细胞的死亡也是由凋亡诱发的。.　第三：我们成功构建了重组腺病毒（Ad-EGFP），将其感染神经干细胞（NSCs），发现其感染效率高，基因表达可持续4周以上；感染后的NSCs仍然具有分化能力并可有效表达报告基因。.　第四：我们将感染Ad-EGFP后的NSCs经圆窗径路植入到正常大鼠耳蜗中。发现植入的干细胞主要在耳蜗底回的前庭阶和鼓阶存活；并且报告基因在各回血管纹、螺旋神经节细胞中也有较明显的表达，但在Corti器的毛细胞和支持细胞中无明显荧光表达。细胞植入后对受体动物的听力和耳蜗形态结构无明显影响。. 第五 ：我们成功构建了慢病毒（LV-EGFP/BCL-2），并进行了体外感染NSCs的实验，取得了初步的结果。. 第六：我们构建了慢病毒（LV-EGFP/Atoh1），并将其经圆窗径路注射到大鼠耳蜗内。发现该慢病毒可以感染毛细胞和支持细胞，并促进支持细胞转化成毛细胞。该方法对正常大鼠的毛细胞数量和听功能没有明显影响。.　 第七：我们进行了经大鼠耳蜗侧壁注射慢病毒载体（LV-EGFP）到耳蜗中阶的实验。发现：LV-EGFP可以在耳蜗Corti 器细胞，螺旋神经节细胞和神经纤维有效表达，但是该方法对受体动物的听功能和耳蜗毛细胞的有较大的影响。.　目前我们正在进行的是LV-EGFP/BCL-2体外感染NSCs的实验，已取得了初步结果，但目前其感染后病毒的阳性表达不高，待改进实验技术后，下一步将进行经圆窗途径将感染目的基因的NSCs植入到正常大鼠及不同浓度乌本苷造成的不同损伤模式的感音神经性损害的大鼠耳蜗中，探讨其抑制耳中毒大鼠耳蜗细胞凋亡及修复损伤细胞的作