传统食品发酵环境宏基因组文库中新型氨肽酶的筛选及功能研究

Aminopeptidase has application value on many fields. However, the present study of aminopeptidase from fungi, therefore to bacteria aminopeptidase gene cloning and function studies need to be strengthened. In this study, to find new bacteria aminopeptidase gene from about 99% or more of the unculturable microbial species, and based on doctoral and post-doctoral work, the applicant build metagenomic library from our traditional fermentation environment sample, and screen novel aminopeptidase gene using substrate-induced gene-expression screening method for high-throughput screening, and enzymology properties research, and by using random mutation technique, determine the key amino acid sites of enzyme catalytic center, clarify the function of the new aminopeptidase. The results not only obtain new aminopeptidase which has potential applications, but also helps to get a comprehensive understanding of aminopeptidase catalytic mechanism and the mechanism of substrate. Therefore, it has a good theoretical significance and application prospect.

氨肽酶在食品、医药等领域具有广泛的应用价值。然而，目前研究的氨肽酶大都来源于真菌，因此对细菌氨肽酶基因的克隆和功能研究亟待加强。为了从占微生物种类99%以上的未培养微生物中寻找新型细菌氨肽酶基因，申请人基于博士及博士后的工作基础，拟从微生物资源独特和丰富的我国传统食品发酵环境样品中建立宏基因组文库，结合SIGEX（底物诱导的基因表达筛选）进行高通量筛选以获得优良特性的氨肽酶基因，然后进行酶学性质的研究，并利用随机突变技术，确定酶催化中心的关键氨基酸位点，阐明新型氨肽酶的功能。研究结果不仅获得了具有应用潜力的新型氨肽酶，而且有助于全面了解氨肽酶的催化机制和底物特异性机理，因此具有重要的理论意义和应用前景。

氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个游离出来的水解酶，主要应用于蛋白质水解、风味肽和生物活性多肽制备以及生物学与医学等领域，具有很高的研究价值和更广阔的应用前景。. 宏基因组学方法避开了传统的微生物分离培养方法，直接从环境样品中提取总基因组DNA，通过构建和筛选宏基因组文库来获得新的功能基因或生物活性物质。宏基因组文库包括了可培养的和未培养的微生物遗传信息，因此增加了获得新的功能基因和生物活性物质的机会。. 本项目通过建立传统食品发酵环境样品的宏基因组文库，利用高通量筛选技术克隆到优良特性的新型氨肽酶基因，并进行酶学性质的研究，然后利用随机突变技术，确定与酶催化活性中心相关的关键位点，最终阐明新型氨肽酶的功能。主要结果如下：. （1）构建了传统食品发酵环境样品的高质量宏基因组文库。. （2）筛选克隆到优良特性的新型氨肽酶基因an_105，该基因全长1485bp，编码495个氨基酸组成的多肽，蛋白序列同源性分析表明，与来自芽孢杆菌类的胞液氨肽酶具有较高的同源性，达到51%，显示氨肽酶AN_105属于新的氨肽酶类。. （3）将筛选出的氨肽酶基因进行有效的外源表达，并纯化得到重组氨肽酶AN_105。. （4）重组氨肽酶蛋白对多种常见底物对大部分的底物具有催化活性，其中催化活性最高的底物为L-亮氨酸-4-硝基苯胺，SDS-PAGE电泳结果表明，纯化后的重组蛋白的分子量约为50kDa，纯化后氨肽酶最适反应pH值分别为7.0，最适反应温度为35℃。. （5）通过三轮易错PCR方法构建了随机突变文库，最终获得酶活性提高的突变酶(An_3T122)。经氨基酸序列比对，发现突变酶共有4个氨基酸发生了替换，突变点分别是E334V、F77L、N86S、V102A。与野生型酶相比较，突变酶的酶活性分别提高近5倍。. 通过这些研究的结果表明，利用宏基因组不仅可以获得具有应用潜力的氨肽酶，有助于全面了解氨肽酶的催化机制和底物特异性机理，而且有利于促进我国传统食品发酵环境资源的开发和利用，因此具有重要的理论意义和应用潜力。.