肌醇与鱼肠细胞Cu/ZnSOD基因转录调控信号分子Nrf2关系研究

鱼肠细胞是营养物质消化吸收的重要功能细胞，但容易引起氧化损伤。营养物质能提高鱼肠细胞抗氧化能力，维护其结构完整性和功能正常。Nrf2是调控哺乳动物抗氧化基因转录的重要信号分子。Cu/ZnSOD在机体抗氧化中起着重要作用。本项目拟利用分子克隆和免疫印迹技术研究信号分子Nrf2在建鲤肠组织中是否存在及其分布规律，采用本课题组研究建立的体外培养细胞模型，利用免疫印迹和基因沉默技术研究信号分子Nrf2是否参与鱼肠细胞Cu/ZnSOD基因转录的调控；进一步在肌醇处理下，考察肌醇是否通过Nrf2调控鱼肠细胞Cu/ZnSOD基因的转录。通过本项目实施可以首次探索信号分子Nrf2在鱼肠组织中是否存在及其分布规律；率先研究其是否参与鱼肠细胞Cu/ZnSOD基因转录调控；率先研究肌醇是否通过Nrf2调控鱼肠细胞Cu/ZnSOD基因的转录，为探索肌醇提高鱼肠细胞Cu/ZnSOD基因转录的机制奠定重要理论基础。

鱼肠细胞是营养物质消化吸收的重要功能细胞，但容易引起氧化损伤。肌醇能提高鱼肠细胞抗氧化能力，维护其结构完整性和功能正常。然而，肌醇提高鱼肠细胞抗氧化能力的作用机制不清楚。Nrf2是调控哺乳动物抗氧化基因转录的重要信号分子。因此，本项目利用RACE技术率先克隆了鲤鱼的Nrf2 cDNA全序列为2557 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，开放阅读框为1761bp，末端有‘AATAAATAAA’的双加尾信号，PolyA尾巴长21bp，该序列已上传至GeneBank，登陆号为JX462955。对Nrf2蛋白分析显示：蛋白质分子量为66071.7Da，等电点为4.49，该蛋白由586个氨基酸残基组成，其中，疏水氨基酸残基、亲水氨基酸残基、酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基分别为155、157、107和58个，分别占全部氨基酸残基总数的26.5%、26.8%、18.3%和9.9%。鲤鱼Nrf2蛋白的二级结构主要包括α-螺旋（41.13%）、β-片层（6.66%）和随机卷曲（52.22%）等结构组成。鲤鱼不同肠段均有Nrf2 mRNA表达，第1肠段最高，第3肠段显著高于第4-7肠段（P < 0.05），第2肠段和第3肠段差异不显著（P > 0.05）。Nrf2 cDNA全序列的克隆为揭示肌醇调控鱼类CuZnSOD基因转录的Nrf2信号途径作用机制奠定了重要的基础。进一步研究发现，肌醇显著提高了幼建鲤前肠和中肠CuZnSOD等基因表达量（P < 0.05）。同时，肌醇上调了幼建鲤前肠和中肠Nrf2基因和总蛋白水平，表明肌醇上调幼建鲤前肠和中肠CuZnSOD等基因表达与其促进Nrf2基因和蛋白水平有关。然而，肌醇对幼建鲤后肠CuZnSOD等基因转录，Nrf2基因和总蛋白水平没有显著影响。本试验结果表明肌醇提高鱼肠CuZnSOD基因转录与信号分子Nrf2有关，并为探索肌醇提高鱼肠细胞CuZnSOD基因转录的Nrf2信号途径作用机制研究奠定重要理论基础。