肌醇调控鱼肠CuZnSOD基因转录的Nrf2信号通路作用机制研究

Intestine is important to nutrient digestion and absorption, especially to stomachless fish, but it is susceptible to oxidative injury. Myo-inositol (MI) can improve the antioxidant capacity of fish intestine, and thus maintain its integrity and function. CuZnSOD is the enzyme known that remove toxic superoxide anions and act as important endogenous antioxidants for protection against oxidative stress. Nrf2 is found in fish intestine, and MI can upregulate the transcription of CuZnSOD gene via Nrf2 pathway, but the mechanism is unclear. Thus, firstly, this project will clone the promoter of CuZnSOD and the genes including sMaf, Keap1 and PKCδ. Then, using bioinformatics and gene recombination technologies, we will study the antioxidant responsive element (ARE) that may locate in the promoter of CuZnSOD gene, and investigate its role in the process of CuZnSOD gene transcription. After that, we will use gene silence technology to investigate whether MI regulates CuZnSOD gene transcription through enhacing Nrf2 nuclei translocation, increasing the binding of Nrf2 and sMaf, and finally activating ARE-mediated CuZnSOD gene transcription. Meanwhile, we will investigate the roles of PKCδ and Keap1 in MI-mediated Nrf2 nuclei translocation.?Summarily, this study will reveal the mechanism of MI-regulated CuZnSOD gene transcription via Nrf2 pathway.

鱼肠道是营养物质消化吸收的重要器官，但易引起氧化损伤破坏其结构，导致功能异常；肌醇能够提高鱼肠道的抗氧化能力，保证其结构完整和功能正常，CuZnSOD在抗氧化中起重要作用；Nrf2存在于鱼肠道中，肌醇可通过Nrf2信号途径上调鱼肠CuZnSOD基因转录，但其作用机制尚不清楚。因此，本项目拟在克隆鱼肠CuZnSOD基因启动子、sMaf、Keap1和PKCδ基因序列的基础上，利用生物信息学和基因重组技术首次研究鱼肠CuZnSOD基因启动子是否含有抗氧化反应元件ARE及其在CuZnSOD基因转录中的作用；利用基因沉默技术率先研究肌醇是否通过促进Nrf2核转位，提高sMaf和Nrf2结合，增强识别结合ARE能力，上调CuZnSOD基因转录；进一步探明肌醇通过影响PKCδ磷酸化、Keap1基因表达、蛋白含量和修饰调控Nrf2核转位的机制；揭示肌醇上调CuZnSOD基因转录的Nrf2信号通路作用机制。

鱼类肠道是营养物质消化吸收的重要器官，但易引起氧化损伤破坏其结构，导致功能异常。肌醇能够提高鱼肠道的抗氧化能力，保证其结构完整和功能正常，CuZnSOD在抗氧化中起重要作用；Nrf2存在于鱼肠道中，肌醇可通过Nrf2信号途径上调鱼肠CuZnSOD基因转录，但其作用机制尚不清楚。因此，本项目在克隆鱼肠 CuZnSOD基因启动子、sMaf、Keap1和 PKCδ基因序列的基础上，首次研究鱼肠 CuZnSOD基因启动子是否含有抗氧化反应元件 ARE及其在 CuZnSOD基因转录中的作用，以及肌醇是否通过促进 Nrf2核转位，提高 sMaf和 Nrf2结合，增强识别结合 ARE能力，上调 CuZnSOD基因转录；进一步探明肌醇通过影响PKCδ和Keap1调控 Nrf2核转位的机制。结果表明：鲤鱼CuZnSOD基因启动子为1675bp，含有1个抗氧化反应元件ARE；PKCδ cDNA全序列为2862bp，开放阅读框2061bp，编码686个氨基酸残基，蛋白质分子量78498.36Da，等电点7.53；Keap1a、Keap1b、MafG1和MafG2部分cDNA分别为843、521、394和344bp；这些基因在鲤鱼肠道均有表达。进一步研究发现：肌醇提高了鲤鱼前肠和中肠细胞核Nrf2的量、MafG的基因和蛋白表达量以及细胞核中Nrf2结合ARE（CuZnSOD）的量；而对后肠Nrf2核转位、MafG基因和蛋白表达、Nrf2结合ARE的量均无显著影响；表明肌醇可促进鲤鱼前肠和中肠Nrf2核转位及核转位后结合ARE激活CuZnSOD基因的转录，但不能通过促进后肠Nrf2核转位来调控CuZnSOD基因转录。此外，肌醇通过上调鲤鱼前肠和中肠Nrf2基因和总蛋白水平、Nrf2和PKCδ磷酸化水平来促进Nrf2核转位；肌醇下调了后肠锚定蛋白Keap1a/b的表达，开始启动上调Nrf2的核转位。以上结果表明：肌醇提高鲤鱼前肠和中肠CuZnSOD基因表达与其促进了Nrf2核转位及Nrf2核转位后与ARE的结合有关；肌醇通过提高前肠和中肠Nrf2的基因和总蛋白水平、Nrf2和PKCδ磷酸化来促进Nrf2的核转位；肌醇降低了后肠锚定蛋白Keap1a/b的基因表达量，开始启动上调Nrf2的核转位。研究结果为揭示肌醇上调 CuZnSOD基因转录的 Nrf2信号通路作用机制奠定了重要的理论基础。