血小板新型活化受体Clec2与平足蛋白相互作用调控肿瘤转移、生长及肿瘤相关血栓形成的分子机制

Platelets play an important role in promoting tumor growth, metastasis, and cancer associated thrombosis. But，its mechanism in these processes is still unclear. Podoplanin (PDPN) expressed on the tumor cell membrane can bind to platelet C-type lectin-like- receptor2 (Clec2) and induce platelet activation and aggregation in vitro. But, it is still unclear that the molecular mechanism of the interactions between platelet membrane receptor Clec2 and PDPN regulats tumor metastasis. In earlier stage, the applicant developed to a monoclonal antibody (mAb)to PDPN, SZ-168. The pre-experiment results demonstrated SZ-168 can block human platelet aggregation induced by cancer cells highly expressing PDPN. A double antibody sandwich ELISA method was developed to detect the plasma soluble PDPN (sPDPN). The project will: (1) Study the mechanism on tumor cells induced platelet activation and activated platelet induced tumor cells migration and proliferation in vitro. (2)Study the molecular mechanism of platelet membrane receptor Clec2 and PDPN interaction on regulating tumor metastasis and tumor associated thrombosis using nude mice model of tumor metastasis and tumor associated thrombosis in vivo and investigate the applicable value of inhibitory mAb SZ-168 in blocking tumor metastasis and tumor associated thrombosis. (3) Determine plasma sPDPN level of tumor patients and investigate the probability of sPDPN as a marker of metastasis or tumor associated thrombosis. In a word, it will possibly provide new clue for development of anti-metastasis or anti-thrombosis medicine and provide a new marker for tumor metastasis. It will be theoretical value and potential in clinical application.

血小板在肿瘤生长，转移和肿瘤相关血栓形成方面发挥重要作用，但其机制尚不清楚。许多表达平足蛋白（PDPN）的肿瘤细胞能与血小板新型活化受体Clec2结合引起血小板活化聚集，但Clec2与PDPN如何调控肿瘤转移和相关血栓形成分子机制尚不清楚。申请者前期研制了抗人PDPN的单抗SZ-168，预实验证实SZ-168能阻断肿瘤细胞诱导血小板聚集，并建立了测定血浆可溶性PDPN（sPDPN）的ELISA方法。本课题将：(1)体外研究肿瘤细胞诱导血小板活化，而活化血小板加速肿瘤细胞迁移和增殖机制 (2)应用肿瘤转移模型和肿瘤相关血栓形成模型明确Clec2与PDPN在体内调控肿瘤转移，生长和血栓形成的分子机制，探讨SZ-168阻断肿瘤转移和血栓形成的价值 (3)测定肿瘤患者血浆中sPDPN的水平，探讨sPDPN作为肿瘤发生，转移和肿瘤相关血栓形成的分子标志物的可能。该课题具有理论价值和临床应用前景

目的：本研究旨在研究PDPN单抗能否在体内抑制肿瘤的生长和转移；并分析血浆sPDPN水平与疾病不良预后及肿瘤转移的相关性；同时探讨血小板hemITAM通路在肿瘤相关性VTE的作用及评估PDPN表达对肺癌患者血栓形成及预后影响。.方法：①经流式细胞术筛选PDPN高表达（PDPN+）细胞系，体外实验研究PDPN单抗SZ168及hemTAM通路Syk抑制及R406行抑制实验；②建立肿瘤裸鼠模型，评估SZ168体内抗肿瘤作用；③免疫组化分析癌症患者组织PDPN表达水平，分析PDPN表达水平是否与VTE发生及不良预后相关。④建立肿瘤血栓裸鼠模型，评估hemITAM通路在肿瘤相关性VTE中的作用。.结果：①SZ168可以剂量依赖抑制C8161，CNE-2等肿瘤细胞诱导的血小板聚集。②SZ168小鼠组的自发性肺转移几乎被SZ168抑制了，镜下见其肺上的癌结节个数（32.50±5.70）明显少于Mouse IgG 小鼠组（231.10±27.25）(P < 0.001) 。③SZ168 IgG组的肿瘤重量（0.63±0.16 g）明显低于Mouse IgG组（0.09±0.04），（P < 0.01）④Mouse IgG组肺表面的结节数量明显多于SZ168 IgG组[（3.83±0.60vs(1.61±0.44)，P < 0.01]。⑤Ⅲ和Ⅳ期患者中血浆的sPDPN的含量高于处于Ⅰ和Ⅱ期的患者；转移的患者的sPDPN含量明显高于无转移的患者。⑥sPDPN作为新的肿瘤标志物，其敏感性和特异性最高。⑦SZ168 可显著抑制 NCI-H226 和 C8161 细胞诱导的血小板活化（401 ±40ng/ml 和 546 ±49ng/ml）。⑧单抗SZ168可以抑制肿瘤相关性的VTE形成。.结论： SZ168具有开发成抗肿瘤转移的抗体药物的潜力。应用单抗SZ-163，SZ-168测定血浆sPDPN的水平有可能成为肿瘤发生和转移的新的分子标志物。SZ168作为一个新型的抗体，可能可以应用到免疫组织化学染色中。单抗SZ168可以抑制肿瘤相关性的VTE，具有抗肿瘤相关性VTE的防治的应用潜力。. 本报告已完成预期研究成果和目标，共发表学术论文13篇，其中SCI论著8篇；参加国内外学术会议交流论文7人次；培养毕业研究生9位; 2019年获得授权国家发明专利1项。