人源化嵌合抗体hSZ-123的抗血栓机制研究

von Willebrand factor (VWF) plays a crucial role in the initiation of arterial thrombosis, by mediating platelet adhesion to the collagen exposed subendothelium at the site of vessel injury. A specific blockade of the VWF A3 domain-collagen interaction or VWF A1 domain-platelet interaction can block the initiation of arterial thrombosis, by blocking platelet adhesion to the collagen exposed subendothelium at the site of vessel injury. Applicant developed an a murine monoclonal antibody, SZ-123, recognized a novel target in VWF A3 domain. Previous studies confirmed that SZ-123 not only blocks the VWF-collagen interaction, but also inhibits the VWF-platelet interaction. SZ-123 also inhibits platelet adhesion to collagen and has anti-arterial thrombosis in vitro and in vivo test. In the based on previous studies, the project will focus on: (1) Murine monoclonal antibody SZ-123 will be rebuilt into humanized chimeric antibody rhSZ-123, (2) The biological functions of hSZ-123 will be investigated, in vitro. (3) The mechanism, advantages and utilization potentiality of hSZ-123 in anti-arterial thrombosis will be futher elucidated, in vivo. The project will provide theory basis for rebuilding monoclonal antibody SZ-123 with independent intellectual property rights into more safe and effective novel antithrombotic drugs.

血管性血友病因子(VWF)在血小板和血管壁之间形成桥梁介导血小板起始黏附到受损的内皮下胶原起着关键的作用，因此阻断VWF功能域A3区与胶原结合或A1区与血小板结合，就可以阻断VWF介导的血小板起始黏附和聚集到受损的内皮下层，就可能从源头(早期)阻断血栓的形成。申请者研制了针对VWFA3区新靶点的单抗SZ-123。前期研究证实SZ-123不仅抑制VWF与胶原相互作用，而且抑制VWF与血小板相互作用，体内、外预试验表明SZ-123抑制猕猴血小板粘附于胶原和具有抗动脉血栓作用。本课题将在前期研究的基础上（1）将鼠源性单抗SZ-123改造成人源化嵌合抗体 hSZ-123，（2）研究hSZ-123的体外生物学功能，（3）进一步阐明hSZ-123在动物体内抗血栓的机制、优势和应用潜力。这将为具有自主知识产权鼠源性单抗SZ-123改造成更加安全有效人源化的抗血栓创新药物提供理论依据

本项目按期完成了预期目标和成果，共发表论文10篇，其中SCI论文4篇，参加国际会议交流论文5篇，授权和申请国家发明专利各1项，毕业研究生5名。本项目分别用PCR方法将鼠源单抗SZ-123基因的可变区序列及信号肽序列扩增，并将重链可变区基因和轻链可变区基因连接到表达载体pMH3中，获得嵌合抗体的重链表达质粒pMH3-MHC-SZ123VH和轻链表达质粒pMH3-MHC-SZ123VK。然后将获得的重组质粒电转移共转入CHO-S细胞。该SZ-123人源化单抗细胞株命名为MHC-SZ123-CHO-S, MHC-SZ123-CHO-S再进行悬浮驯化和摇瓶流加表达，表达量约为200mg/L。经超滤浓缩和采用protein A亲和层析法纯化MHC-SZ123 IgG。体外实验表明， MHC-SZ123不仅能抑制血浆中VWF与胶原的结合，而且能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。在苏州西山中科实验动物有限公司对20只猕猴建立了体内动脉血栓形成Folts模型，观察静脉注射给药MHC-SZ123（动物分成四组0， 0.1， 0.3， 0.6 mg/Kg体重）前后1小时内周期性血流减低（CFR）发生次数的改变。单抗MHC-SZ123低、中、高剂量组CFR抑制率分别为29.4% ± 3.7%、57.9% ± 7.4%、73.1% ± 4.9%，不同剂量的MHC-SZ123组与生理盐水组相比，对于CFR抑制率的差异非常显著（P<0.01）；在给药后的15分钟至1小时以内，嵌合抗体MHC-SZ123低、中、高剂量组对于血浆中VWF与胶原的结合的抑制作用均保持在峰值，其抑制率分别接近33%、51%和92%；在给药后的30分钟以内，嵌合抗体MHC-SZ123低、中、高剂量组对血小板聚集的抑制作用均达到最大抑制率，分别为25.8％± 4.7%, 43.4％± 8.0%,62.1％± 8.6%；MHC-SZ123对猕猴体内 PLT、BT、PT、TT、APTT、Fg和VWF水平等均未观察到具有统计学差异的改变。.总之，该人源化抗体MHC-SZ123可以应用于防止各种原因导致的血小板血栓形成以及血管成形术后再形成血栓的情况。MHC-SZ123所针对的新靶点是VWF，而不是血小板，因此在给药后不会引起血小板的下降和出血时间的延长，大大减少了临床出血风险的发生。MHC-SZ123具有良好的应用前景和优势.