血管性血友病因子（VWF）结构域的功能分析及其在动脉血栓形成中的作用机制

血管性血友病因子(VWF)在血小板和血管壁之间形成桥梁介导血小板黏附到受损的内皮下胶原，胶原-VWF-血小板膜糖蛋白（GP）Ib轴各分子间相互作用是血栓形成的始动环节，也是研究血栓形成机制、寻找抗血栓的新靶点。申请者研制了两株针对VWFA3结构域为新靶点的抗血小板粘附的单抗（SZ-123和 SZ-125）。前期研究证实两株单抗不仅抑制VWF与胶原相互作用，而且抑制VWF与血小板相互作用，在体外模拟动脉高剪切力血流状态下，两单抗抑制血小板粘附于胶原。本课题将在前期研究的基础上（1）确定这两株单抗结合VWFA3结构域的精确氨基酸定位，揭示VWF与胶原结合的分子机制；（2）明确VWFA3结构域如何调节VWFA1结构域与GPIb相互作用的分子机制，从而深入阐明胶原-VWF-血小板膜GPIb轴各分子间相互作用如何启动动脉血栓形成的分子机制。

血管性血友病因子(VWF)在血小板和血管壁之间形成桥梁介导血小板黏附到受损的内皮下胶原，胶原-VWF-血小板膜糖蛋白（GP）Ib轴各分子间相互作用是血栓形成的始动环节，也是研究血栓形成机制、寻找抗血栓的新靶点。. 本项目在国家基金会面上项目的资助下经过三年努力完成了各项指标。（1）完成了rVWF-A1A2A3三联体表达载体在大肠杆菌和CHO细胞中的表达，（2）利用质辅助激光解析电离飞行时间质谱法和合成多肽方法确定了单抗SZ-123/SZ-125在VWFA3区的抗原氨基酸定位，（3）表达的重组蛋白rVWFA1和A3，以及rVWFA1A2A3分别在静态和剪切力条件进行了两者间的结合试验。亲和实验表明，分离状态的rVWFA3能与rVWFA1结合,其亲和常数Ka=6.5*108L/mol；SZ-123单抗能增强A1和A3的结合，从而掩盖了血小板GPIb在VWFA1区的结合位点。因此我们的试验结果表明VWFA1与A3区在自然状态下是相互作用的，而且当单抗SZ-123结合在VWFA3区后通过增强A1与A3区的结合来干扰和阻断VWFA1与血小板GPIb的结合，最终我们明确了单抗SZ-123VWFA3结构域如何调节VWFA1结构域与GPIb相互作用的分子机制。（4）无论在变性条件还是剪切力条件下SZ-123对ADAMTS13水解VWF的活性无影响作用；相对地，SZ-34在高剪切力条件下对ADAMTS13裂解VWF的活性具有明显抑制作用，并且呈剂量依赖性抑制（5）研制了抗GPIb单抗SZ-151，并且以该单抗建立了VWF瑞斯妥霉素辅因子检测试剂盒，该试剂盒可用于VWF与GPIb相互作用的基础研究，也可用于血管性血友病的鉴别诊断，具有较高的临床应用价值。（6）本项目还进行了新型抗血小板粘附单抗SZ-123动物体内抗血栓药效学实验。应用动脉血栓Folts模型研究首次证明抗VWF A3区单抗SZ-123在猕猴体内的抗血栓作用，而且单抗SZ-123对猕猴体内血小板数没有显著下降，出血时间不延长，凝血功能不影响，作为抗血栓药物没有出血副作用，降低出血的风险，将是一个安全的抗血栓物。. 本项目共发表学术论文11篇，其中SCI收录7篇：共参加学术会议交流论文9次，其中国际会议5次。共申请国家发明专利3个，其中授权1个。共培养研究生5名。