利用新型基因敲除和细胞转移技术建立人源化肝脏猪的模型

Hunam hepatocytes and large animal models with humanized livers，such as pig，are more and more required in today's research and apllication in biomedical field. The goal of this application is to achieve a pig model with humanized liver by using several novel techniques. Non-integrated lentiviral vector combining with zinc finger nuclease technique will be used to target fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) in fetal fibroblasts of Tibet Minipig for generating Fah knockout Fah (-/-) fibroblasts. The nuclei of Fah （-/-）fibroblasts will be used to generate Fah（-/-） pig by using somatic nuclei tranfer technique. The Fah（-/-） piglets are expected to be obtained finally and will be proved by the results of deletion of Fah in genmoic DNA, losing Fah protein expression and losing Fah relative metabolic activities. The clony of Fah （-/-） pig will be expended for following researches. Liver repopulation in Fah(-/-) pig will be proved in transplantation assay by using singenic pig hepatocytess as donor cells. The Fah (-/-) pigs will be treated with relavant immune suppression agents for achieving immunodeficiency for xeno-engraftment of donor human hepatocytes.Donor hepatocytes will be labeled by luciferase for non-invasive detection of liver repopulation with luminescent imaging system. Compared with immunohistchemical assay of detection on donor hunam hepatocytes in homing and repopulation, luminescent imaging system will be more efficiently to detect liver repopulation and liver reconstruction. Our generated pig models with humanized liver will have great potential for proving the hepatic function of stem cell-derived human hepatocytes, for in vivo expending of human hepatoctyes in pig livers. In the future, humanized liver in pig will also be used as the model in the studies of new drug discovery, while they will be studied as substitute for human liver for liver transplantation.

医药行业对人肝实质细胞的需求已经成为一个亟待解决的问题。建立人源化肝脏的猪模型有利于扩增人肝实质细胞和由干细胞诱导产生的人肝细胞，为再生医学和药物筛选提供手段。本课题将首次建立人源化肝脏的猪模型。通过应用非整合型慢病毒结合锌指核酸酶技术，在西藏小型猪的胚胎成纤维细胞中敲除延胡索酸乙酰乙酸脱氢酶（Fah）基因。应用核移植克隆技术获得Fah(-/-)纯合子猪。应用基因、蛋白和生理性状等方法鉴定Fah(-/-)猪的预期表型并繁育扩增。Fah(-/-)猪将被用于同种和人的肝细胞移植研究，以期获得猪和人的肝细胞再殖，最终获得人源化肝脏的猪模型。并利用改进的荧光素酶标记供体肝细胞技术实现无创伤追踪监测供体细胞在受体内的归巢和增殖行为。为提高人肝细胞的再殖，将应用特殊的免疫抑制剂降低人肝细胞在受体猪中的免疫排斥，实现人肝功能在猪肝中的重建。由此制备的人源化肝脏和扩增的人肝细胞可应用于医药研究和器官移植。

首先，2016年12月17日，南方医科大学首批利用CRISPR/Cas9 基因敲除技术创制的白化西藏小型猪的诞生，标志着本单位承担的项目“构筑制作遗传工程小型猪的社会化服务支撑平台”取得突破性进展，同时该利用自主力量构筑的平台将为广州及周边地区的生命科学和药物研究提供服务。其次，独立自主的依靠自身力量创制白化西藏小型猪，预示我们已熟练掌握了通过Cas9 mRNA和sgRNA猪受精卵细胞质内共注射，制备基因敲除猪所涉及的关键技术环节（包括上游工作、中游工作和下游工作），我们接下来拟借助该支撑平台采用Cas9 mRNA和Fah-sgRNAs受精卵胞质内注射法制备Fah基因敲除的西藏小型猪。第三，作为合作单位，内蒙古大学动物中心课题组，按照基金申请书中拟定的研究计划，已顺利地完成了各项实验工作，其中包括：1）诱导产生肝脏损伤；2）分离纯化人肝实质细胞（包括成体肝脏和流产儿肝脏分离的），移植到具有多基因敲除的，带有免疫缺陷和诱导型肝损伤的大动物模型（大鼠）中；3）待移植了人肝实质细胞的动物中，肝脏恢复健康后，成功获得了肝损伤干细胞移植设计分析；肝再植后的分析结果（其中包括：肝脏代谢，毒理，肝炎病毒侵染）。在本基金资助的研究过程中，对相关的动物细胞移植和再植的技术研究探讨，也广泛有益于本内蒙古大学动物中心课题组的多个课题的实验技术发展。总之，基于制药工业和转化医学两方面对人肝细胞的广泛需要和巨大的经济效益，本课题旨在建立Fah基因纯合敲除大动物模型，并以该模型开展异种移植研究，以获得大量扩增的人肝细胞。获得的人肝细胞可广泛应用于制药工业的药物代谢和药物毒理研究、制作人工生物肝装置及开展肝炎病毒的疫苗研究。人肝细胞组成的人源化肝脏还可能是肝移植的理想替代供体，将在再生医学研究中发挥重要作用。第四，在基金委的资助下，共培养博士研究生1名和硕士研究生4名。目前已有6篇文章发表，其中4篇发表于国外SCI科学期刊。