利用CRISPR/Cas9技术培育Fah和Rag2双基因敲除小型猪“生产”人肝细胞治疗肝衰竭的研究

There is a critical shortage of human hepatocytes which are needed to study liver disease and for development of novel diagnostic and therapeutic applications including bioartificial liver (BAL) and Tissue engineering liver (TEL) support therapy. To address this critical shortage and provide a broadly useful hepatic xenorepopulation system, we plan to bioengineera mini pigmodel of Hereditary tyrosinemia type 1 via knock-out the fumaryl acetoacetate (Fah) gene of tyrosine metabolism and with severely immunodeficient via recombination activating gene (Rag) 2mutations through CRISPR/Cas9 technique.Fah-Deficient mini pigs are intended to serve as in vivo incubators for large scale production of primary human hepatocytes.Fah and Rag2 deficient mice have already been described, as have their ability to serve as in vivo incubators for small-scale production of human hepatocytes. An in vivo milieu appears to be essential for robust expansion of primary hepatocytes and for normal differentiation of stem cells and hepatocyte-like cells into mature hepatocytes.The limitation of Fah-deficient mice is that they produce less than 10e8 of human hepatocytes per mouse. Fah deficient mini pigs are expected to produce 1-2×10e10 of human hepatocytes per pig, an adequate supply for BAL and TEL therapy.

缺乏人肝细胞的稳定来源极大地阻碍了肝脏疾病基础研究和生物人工肝（BAL）及组织工程肝（TEL）等新兴疗法的发展。我们的前期研究表明猪Fah 基因缺失将造成酪氨酸血症Ⅰ型，存在广泛且持续的肝损伤,适合移植肝细胞再殖。同时文献报道Rag2 基因缺失造成猪严重免疫缺陷，适合异种细胞移植。肝脏内环境是原代肝细胞恢复强大增殖能力，各种干细胞来源的肝样细胞分化为成熟肝细胞的必要条件。本研究中，我们将利用CRISPR/Cas9技术培育Fah-/-Rag2-/-小型猪作为人肝细胞大规模生产的异种生物反应器。已经有文献报道Fah-/-Rag2-/-小鼠可以作为人肝细胞的 “生产车间”。但受限于体型，每只Fah-/-Rag2-/-小鼠只能“生产”不足10e8个人肝细胞，而每头Fah-/-Rag2-/-小型猪将能够“生产”1-2×10e10个人肝细胞，将为BAL和TEL的临床应用提供充足的细胞。

本项目成功利用CRISPR/Cas9和SCNT技术获得Fah-/- Rag2-/-巴马小型猪，但Fah-/-Rag2-/-巴马小型猪流产率高，身体虚弱不易饲养，同时我们的研究证明人肝细胞并没有在猪肝中大规模的扩增,反而是逐渐被猪免疫系统清除掉。因此，单独敲除Rag2-基因还不能够完全消除猪免疫系统对异种细胞的毒性。Fah-/- Rag2-/-巴马小型猪的肝脏还不能完成为扩增人肝细胞的“生物反应器”。我们进一步完善了SCNT技术中细胞核来源中猪高效gRNA筛选平台和基于图案微阵列的细胞单克隆获取技术。同时，设计并采用带有受精卵特异性启动子的Ⅵ型rAAV作为载体将sgRNA和Cas9基因转染到输卵管内的受精卵中，完成基因编辑。与传统方法采用1.分离胚胎成纤维细胞、2.体外基因敲除、3.分离培养卵细胞、4.体细胞核移植、5.体外胚胎培养、6.胚胎移植，相比，极大的降低了基因敲除的技术难度，节约了培育时间和成本。随着近年异种移植领域取得的重要进展，我们转向低免疫排斥和无危害猪肝细胞作为肝细胞来源的研究。我们利用巴马小型猪原代肝细胞培养肝类器官，用于华西医院肝类器官生物人工肝治疗恒河猴爆发性肝衰竭模型，可以明显延长恒河猴FHF模型的生存率与生存时间。我们的生物人工肝技术转让美国Mayo Clinic,目前已进入美国临床试验。通过本项目，我们已经完全掌握了猪的基因编辑技术，后续计划在今年年底获得GGTA1和PERVs双敲除的巴马小型猪作为生物人工肝肝细胞供源，用于新设计的类器官生物人工肝设备中开始临床前大动物治疗实验。为进一步临床治疗中国肝衰竭患者打下基础。