利用ES细胞基因操作新技术快速构建免疫基因人源化小鼠

Humanized gene system or disease model of mice can be constructed via replacing mouse counterparts using human normal or mutated genes，e.g.genetically humanized mice. Therein immune system gene humanized mice are very important for the R&D of biomedicine,however, there were few research on this field in China. Applicant in Germany laboratory transferred the mega-sized human T cell receptor (TCR) loci into mouse ES cells, and first successfully established TCR gene loci transgenic mice in the world,further constructed TCR-HLA humanized mice by crossing with HLA-A2 transgenic and MHC-I knockout mice. During the construction of these mice, applicant found that previous HLA transgenic mice express low level of HLA molecules and had abnormality of CD8 T cell development. To improve TCR-HLA humanized mice, we propose to generate the new generation of HLA-B2M knockin mice by using new technologies of TALEN, dual RMCE and Recombineering et al to replace mouse B2m and H2 D gene coding region with human B2M and HLA-A2 key coding sequence under the control of mouse regulatory elements, and then crosssing these mice together to generate better HLA gene humanized mice, supplying a new R&D platform for antiviral and antitumor immunology.

用人类正常或突变基因置换小鼠同类基因可在小鼠体内建立更接近人类的基因体系或疾病模型，即人源化小鼠。其中免疫系统基因人源化小鼠对生物医药的研发尤为重要，但国内少有这方面的研究。申请者曾在德国实验室将巨大的人T细胞受体（TCR）基因位点转入小鼠胚胎干细胞内，在世界上首先成功建立了TCR基因位点转基因小鼠，并进一步培育了TCR-HLA人源化小鼠，在研制此小鼠的过程中发现现有的HLA转基因小鼠HLA表达低下和CD8 T细胞发育异常。为了优化HLA人源化小鼠，我们提出用TALEN和RMCE等新技术以小鼠B2m和H2 D位点为靶基因开展免疫基因人源化研究。将小鼠B2m和H2D基因编码区原位置换为人B2M和HLA-A2基因编码区，而依然使用小鼠的基因表达控制元件。最后将上述小鼠培育成具有知识产权的更完善的T细胞抗原识别系统HLA-B2M基因人源化小鼠，为抗病毒抗肿瘤免疫研究建立一个新的研发平台。

用人类正常或突变基因置换小鼠同类基因可在小鼠体内建立更接近人类的基因体系或疾病模型，即人源化小鼠。其中免疫系统基因人源化小鼠对生物医药的研发尤为重要。CRISPR/CAS9基因编辑新技术的出现给我们新的机会快速修改基因组序列。我们成功地利用CRISPR/CAS9基因编辑新技术，敲除了小鼠MHC重链的H2基因（K1和D1）以及MHC轻链B2M基因。目前正在与HLA转基因小鼠交配以得到最终的HLA人源化小鼠。由于动物实验的周期很长，实验还在进行中。最后将上述小鼠培育成具有知识产权的更完善的T细胞抗原识别系统HLA-B2M基因人源化小鼠，为抗病毒抗肿瘤免疫研究建立一个新的研发平台，为未来开展其他小鼠基因人源化奠定基础。. 我们还建立了DNA重组酶介导的基因置换技术，用于TCR基因转移和TCR-T细胞治疗研究。抗肿瘤T细胞受体(T cell receptor, TCR)基因治疗在临床上已获得了巨大进展, 但仍然存在一些技术瓶颈。例如, 内外源性TCR链随机组合形成自身反应性TCR分子、外源基因随机插入导致抑癌基因灭活等。为解决这些问题, 我们提出建立低/单拷贝TCR基因置换技术: 即结合逆转录病毒和重组酶介导的盒式交换(RMCE)技术, 实现TCR基因定点置换以构建TCR稳定表达系统。首先通过逆转录病毒转导在16.113和Jurkat76细胞引入了含有loxP和FRT位点的EGFP基因; 然后利用RMCE方法, 将EGFP置换成MAGE-A1的TCRalphabeta基因, 置换效率高达5%。在Jurkat76细胞表面检测到了TCR和CD3分子, 并能与MAGE-A1特异性HLA-A2多聚体结合。预计利用这一TCR基因置换系统结合干细胞技术可快速产生抗原特异性的T细胞, 为TCR-T细胞治疗的安全应用提供一个新策略。