高温噬菌体M23家族蛋白酶对肽聚糖降解的机制研究

M23 family proteases have endopeptidase and amidase enzyme activities and can degrade the bacterial cell wall peptidoglycan. As a new type of enzybiotics, they have get more attention recently. To date, no M23 family proteases from thermophilic bacteria phage has been investigated in details. TSPpgh and MMPpgh were M23 family protease encoded in Thermus bacteriol phages with the function of lysis bacteriol peptidoglycan. They had the molecular weight of less than 25KDa and had very high thermostability. Especially, in 37 ℃ or so, they showed lethal activity against some of gram-positive and negative bacteria.. In this project, bioinformatics, NMR analysis and sites mutation will be used to recognized TSPpgh and MMPpgh's space structures，conserved domains and the key active sites which played important roles in peptidoglycan binding and degradation, respectively. And LC-MS chromatography will be used to analyzed the TSPpgh and MMPpgh's peptidoglycan hydrolysis products and hydrolysis sites. Finely， the mechanism of enzyme degradation of peptidoglycan will be discovered according to their structural and functional characteristics. . In addition, investigation of TSPpgh and MMPpgh's lethal activity against bacteria will benefit us to find new types of enzybiotics, and promote the application of new type lysins from thermophilic bacteriophages.

M23家族蛋白酶具有内肽酶和酰胺酶活性，能降解细菌细胞壁肽聚糖，作为新型的蛋白类抗生素倍受到关注。目前来源于高温菌噬菌体的M23家族蛋白酶还未见研究。TSPpgh和MMPpgh为来源于栖热菌噬菌体的M23家族蛋白酶，在噬菌体中发挥裂解酶降解细胞壁的功能，其分子量小于25KDa，热稳定性高，在37℃左右还能对多株革兰氏阳性菌性和阴性细菌具有裂解致死活性。. 本项目拟通过生物信息学分析、NMR核磁共振结构解析及位点突变验证，研究TSPpgh和MMPpgh的空间结构、保守区域及对肽聚糖吸附、降解起关键作用的活性位点；并通过液质联用色谱分析它们水解肽聚糖的产物，探明对肽聚糖的酶切位点，最终从结构和功能上阐明这些特殊来源的M23家族蛋白酶类高温裂解酶对肽聚糖降解的机制。研究TSPpgh和MMPpgh对不同菌株的裂解致死活性，将为发现新型酶抗生素、促进高温菌裂解酶的应用奠定基础。

M23家族蛋白酶具有内肽酶和酰胺酶活性，能降解细菌细胞壁肽聚糖，TSPpgh和MMPpgh为来源于栖热菌噬菌体的M23家族蛋白酶，在噬菌体中发挥裂解酶降解细胞壁的功能。本项目拟阐明高温裂解酶对肽聚糖降解的机制，特别是研究裂解酶对多种耐药性细菌具有显著的裂解效果，为发现新型酶抗生素、促进高温菌裂解酶的应用奠定基础。.将高温噬菌体裂解酶基因TSPpgh、MMPpgh进行克隆表达，纯化的裂解酶两者在28-65℃均有活性，在pH7-8时活性最高，对不同菌株的抑菌活性上有一定差异。将浓度为20-100微克/mL的两种裂解酶分别与一定浓度的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的培养液混合孵育，在裂解酶的作用下以上菌体均会降解，细胞质外溢，活菌数可以下降1-4个数量级。.在37℃时，裂解酶对耐药性大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性和阴性菌体均有杀灭效果，显示出较广抑菌谱。所构建的含以上两种裂解酶的嵌合裂解酶具有比单独裂解酶更高的活性、杀菌效率和杀菌谱。裂解酶还能够有效抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物被膜的形成，同时对已经形成的生物被膜有降解作用，裂解酶TSPphg与抗生素联用抑菌时，能显著降低了抗生素的使用量。.生物信息学分析表明，两种裂解酶均属于M23B蛋白酶家族，催化中心含一个锌离子，motif HXXXD和HXH构成其活性位点，起催化作用的是motif HXH中的第一个His，突变后的酶丧失了酶活。裂解酶不但能水解弹性蛋白，通过质谱分析其对肽聚糖水解的产物初步判断，其能水解肽聚糖的氮乙酰葡萄糖氨和氮乙酰胞壁酸之间的糖苷键位点，证明了裂解酶对肽聚糖的降解机制，是一类比较特殊的双功能水解酶。.本项目还构建了裂解酶的高密度发酵体系，在20L发酵罐发酵25h生物量可达OD600为60，发酵液中裂解酶浓度达3mg/mL。将裂解酶用于治疗耐药性金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染时，其与卡那霉素有类似的治疗效果。进一步将其做为饲料添加剂使用，有效改善白羽肉鸡生长性能，对维持肠道健康有较好功效。.综上所述，本研究涉及的高温裂解酶稳定性高，具有较好的抑菌和抑制生物被膜形成的功能，有望成为新型的抗菌物质，为抗生素替代技术提供了新的思路。