腾冲热海栖热菌噬菌体TSPcpn47蛋白的分子伴侣特征研究

高温噬菌体因其独特的基因组成和进化特征，使其倍受关注。在前期研究中，项目组完成了栖热菌噬菌体TSP4的基因组解析，并推测TSP4基因组上的ORF47可能表达为与原核生物ClpB相似的分子伴侣蛋白，命名此蛋白为TSPcpn47。初步实验表明，TSPcpn47具备一定的分子伴侣基本特征。鉴于分子伴侣在生命活动中的重要意义，且在高温噬菌体（病毒）中，未见病毒分子伴侣研究的相关报道，本研究拟通过ATP结合位点突变分析、变性蛋白与复性分析、表面等离子共振分析等方法，研究TSPcpn47的ATP水解活性、防止变形蛋白聚集以及促进变性蛋白复性、与变性蛋白结合能力等特征，并通过其对Tsp4噬菌体功能蛋白热稳定性影响研究，进一步探讨TSPcpn47的分子伴侣功能。.项目研究将有助于发现新的分子伴侣类型及其功能，对其在提高蛋白质热稳定性的作用和功能研究，对探索高温噬菌体在高温环境下的适应性机制也有其特殊意义。

分子伴侣(molecular chaperones)是一类在进化上非常保守的蛋白质家族, 它能非特异性结合不同的蛋白质并催化介导这些蛋白质形成特定的构象, 在生物体内起着稳定新生蛋白、辅助其他蛋白质正确折叠、组装、转运甚至降解的作用。.本研究的分子伴侣TSPcpn47蛋白来源于高温菌噬菌体TSP4，对其进行了以下研究。.1.从生物信息学上分析TSPcpn47属于AAA+家族，含有2个motif分别为walker A motif和Walker B motif；但与目前已研究的其它分子伴侣的同源性普遍较低。利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性，确定了E.coli Rosseta 菌株为TSPcpn47基因表达的适合宿主菌，并完成TSPcpn47的克隆表达和纯化。.2.验证了TSPcpn47蛋白具有ATPase活性，其在60℃下所测得的酶活力最高。具备ATP酶活性是分子伴侣的基本特征。.3.验证了TSPcpn47蛋白能形成聚合体，具备形成聚合体也是分子伴侣的基本特征。但其聚合体的形成需要在一定的缓冲液、温度和Mg2+浓度条件下才能形成。在pH7.8的300mM咪唑缓冲液中，20mM MgCl2，4mM ATP，TSPcpn47的浓度为0.08μg/μL，处理方法为先37℃温育4h后4℃冷藏8h不变的条件下。.4.验证了TSPcpn47蛋白具备和dUTPase蛋白结合形成复合物的能力。TSPcpn47蛋白和其它蛋白结合，是其发挥其分子伴侣功能的重要基础。.5.验证了TSPcpn47蛋白具备提高蛋白质热稳定性的功能，添加TSPcpn47蛋白能显著提高来源于噬菌体TSP4的裂解酶和dUTPase在高温下的剩余酶活力，对来源于常温酶的胆碱酯酶在高温下的酶活力也有明显的保护作用。.6.此外TSPcpn47蛋白不仅能够帮助变性的GFP蛋白复性，使GFP恢复到原始荧光强度的65%以上，而且在60℃温度处理1h以后，还能够保存GFP蛋白50%以上的荧光强度，比对照组高出30%。.总之，分子伴侣在噬菌体中是非常罕见的，对TSPcpn47蛋白的研究不但有助于探索其耐热机制，TSPcpn47对蛋白热稳定性具有的保护作用也使其具有广泛、潜在工业应用价值。