腾冲热海栖热菌高温噬菌体基因组比较及重要功能蛋白的热稳定性分析

高温噬菌体因其独特的基因组成和进化特征，使其倍受关注。在前期研究中，项目组从腾冲热海热泉分离到三株最适感染温度各异的长尾噬菌体科高温噬菌体，为比较研究高温噬菌体的基因组成特征，探索其功能蛋白的热稳定性提供了理想的材料。项目组拟在已完成其中一株长尾噬菌体科噬菌体全基因组解析的基础上，继续完成另两株噬菌体基因组的测序及解析，比较它们在基因组成上的共性、差异及可塑性；并利用蛋白质序列平均氨基酸熵值分析法（LSE），预测噬菌体重要功能蛋白的热稳定性及差异；同时，克隆表达和分离纯化这三株高温噬菌体高温适应的关键蛋白- - DNA解旋酶，并实测解旋酶的热稳定性，结合理论和实际分析结果，初步探索解旋酶氨基酸序列组成特征与其热稳定性的关系。.项目研究不仅可以获得一批独特的高温噬菌体基因资源，对噬菌体重要功能蛋白质热稳定性的分析，还将有助于阐明高温噬菌体的适应性机制，在更高的层次上探索高温噬菌体生命活动的过程。

栖热菌（Thermus. sp）是探索高温菌嗜热机制的重要模式菌株，其研究的重要性充分体现于来源于栖热菌的耐热Taq DNA聚合酶。如今，这些感染栖热菌的高温栖热菌噬菌体，因其独特的基因组成及进化特征，在研究中日益受到关注。. 本项目对TSP4的分子伴侣TSPcpn47、解旋酶、裂解酶、dCTP脱氨酶的基因进行克隆表达，分析其酶学特征，并证明它们均具有高温酶在高温下的催化活性，这些蛋白同时具有其独特的功能，为探索嗜热噬菌体基因开发利用奠定了扎实的基础。. TSP4的分子伴侣TSPcpn47的发现是本研究的亮点之一，其具有提高蛋白质热稳定性的能力，对TSP4裂解酶TSPLysin的研究发现，TSP4裂解酶不仅能从菌体外裂解活的革兰氏阴性菌TC16宿主菌，而且能裂解革兰氏阳性的嗜热土芽孢杆菌菌体，甚至大肠杆菌菌体，可见其具有多功能的菌体裂解能力，无疑将有可能作为一种热稳定性很好的生物杀菌剂，值得进一步研究。. 蛋白质的氨基酸熵值与蛋白质热稳定性有关，通常情况下，蛋白质熵值降低，蛋白质的热稳定性会加强，反则反之。本研究通过对高温宿主菌TC16 单链结合蛋白TSB和常温菌E.coli单链结合蛋白ESB的氨基酸熵值分布特征进行对比分析，根据TSB和ESB在熵值分布上的差异，总结出提高蛋白质热稳定性的基本策略。1.整体蛋白内避免长区域的高/低结构熵板块；2.当功能残基位点为高结构熵时，周围需要低结构熵的残基对其进行维护；3.与策略2相反，当功能残基位点拥有低结构熵值时，周围需要相对高的结构熵来维护其的高活性。. 在此基础上，以高温栖热菌dCTP脱氨酶为基础，分别通过基因突变及克隆表达获得蛋白质熵值升高和熵值降低的两个突变体，对它们的热稳定性分析表明，蛋白质熵值升高的突变体热稳定性降低，而蛋白质熵值降低的突变体热稳定性升高，验证了以上的结论，也证明本研究提出的改造蛋白质热稳定性的策略是正确的，值得进一步研究。. 此外，本项目还完成了一株嗜酸热古菌硫化叶菌STSV2病毒和世界上首次分离到的亚栖热菌噬菌体MMP17的测序和基因组解析。. 总之，项目研究获得了一批高温噬菌体基因资源，对蛋白质热稳定性机制和热稳定性改造的研究，也力求在理论上进行有益的探索。