宫颈癌差异表达蛋白BLCAP及其靶分子在细胞信号转导通路中的作用

BLCAP（膀胱癌相关蛋白）基因是2002年登录GenBank的候选抑癌基因。研究表明该基因在多种恶性肿瘤中表现出抑癌功能。本室在国家自然科学基金的资助下通过原癌/ 抑癌基因分类表达芯片筛选以及RT-PCR检测，发现blcap在宫颈癌组织中表达下调或缺失；细胞生长及凋亡、裸鼠成瘤等试验确认了blcap的抑癌功能；并证实了blcap过表达是以非依赖p53和NF-κB的新方式调节细胞增埴和细胞凋亡。近来，用RNAi试验和肿瘤信号传导基因芯片分析将blcap抑癌作用的可能途径锁定于细胞周期调控通路G1 to S cellcycle调控节点。本研究将通过pulldown、生物质谱分析、染色质免疫共沉淀等生物大分子相互作用技术确定BLCAP作用的靶分子，探讨blcap在细胞周期基因网络中的作用与地位，其失活与肿瘤发生和发展的关系及分子机制，并探讨BLCAP作为临床应用新靶点的可能性。

在前一个国家基金的资助下，对膀胱癌相关蛋白（BLCAP）基因体外和体内生物学功能进行了研究，首次提出BLCAP的异常表达与宫颈癌的发生和发展密切相关，很可能是一个潜在的宫颈癌抑癌基因。在本项目中，通过细胞信号传导芯片分析了三种HeLa细胞（野生型、稳定转染BLCAP基因和siRNA-BLCAP干扰的HeLa细胞）中BLCAP差异表达变化。芯片功能分析锁定了BLCAP发挥抑癌功能的潜在作用途径G1/S细胞周期信号通路；通过对该信号通路上27个差异表达蛋白的表达分析，重点考虑视网膜母细胞瘤基因（Rb）与BLCAP的关联。我们利用RT-PCR、Western-Blot和蛋白质免疫共沉淀等生物大分子相互作用技术检测了Rb以及磷酸化Rb、细胞周期调节蛋白cyclinD1, CDK4, CDK6和E2F的表达情况；根据BLCAP基因存在三个潜在功能域：SPXX、PXXP和78S序列，分别构建相应的三种突变异构体：SAXX 、AXXA和Ala78；检测了突变重组体对细胞周期调控因子表达的影响；探讨BLCAP的亚细胞定位及其组织分布。结果显示：在BLCAP基因转染细胞中，BLCAP的mRNA和BLCAP蛋白水平高表达的同时，RB的mRNA水平和RB1蛋白的水平也明显增高；但磷酸化RB蛋白表达及pRb/Rb1下调；在生理状况下BLCAP可与RB1及pRb免疫共沉淀；AXXA和Ala78突变体和野生型BLCAP蛋白质一样，均可以抑制细胞周期G1/S期相关蛋白质的表达。而SAXX突变体缺失了野生型BLCAP对HeLa细胞的生长抑制作用并可促进pRB1的表达，是BLCAP蛋白质的关键功能区；激光共聚焦显微镜检测BLCAP在胞核、胞浆都有分布，免疫荧光技术动态观察BLCAP表达开始以胞浆分布为主，36小时后向胞核中聚集；免疫组化检测正常组织BLCAP表达量明显多于癌组织（宫颈、乳腺组织）。根据上述结果，我们认为BLCAP基因是一个调节细胞生长的重要的看家基因，是细胞信号转导网络中的重要分子，BLCAP通过与RB等细胞周期调控蛋白的相互作用，阻止细胞通过G1/S节点，从而发挥其细胞周期负调控以及抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的功能，SPXX序列结构域是BLCAP蛋白的关键功能域。本研究为探索BLCAP-Rb在细胞周期通路中的作用机制及BLCAP作为临床肿瘤诊断与治疗新靶分子提供了线索。