功能核酸的优化策略：10-23脱氧核酶的化学修饰与催化功能优化

Various natural nucleic acids have been found in biosystem and artificial nucleic acids selected by in vitro selection. Their great potential as genetic modulation tools and therapeutics has intrigued enormous interest in structure-activity relationship and optimization of functional nucleic acids. In this project, we emphasized that in functional nucleic acids, nucleobases and their sequences are specific and conservative, and each nucleobase has its own rich structural information, their planar stacking and functional group distribution are responsible for building the active conformation. 10-23 DNAzyme is utilized as the model for this kind of research, for a better catalytic activity and anti-enzymatic stability. Two modification strategies are proposed: chemical modification on the nucleobases at the level of functional groups and the optimization of spacial position of nucleobases in the catalytic core. The former will be realized with 16 nucleoside analogues with or without protein-like functional groups, and the latter with isonucleosides and their enantiomers (6 compounds). Especially, isonucleosides in the catalytic core and the recognition arms will also be favorable for the stability against enzymatic digestion. More efficient DNAzymes will be selected with short DNA-RNA-DNA substrates, and the research on the catalytic mechanism and conformation will be conducted with the factors related to the reaction and molecular dynamics simulation. The more efficient DNAzymes will be evaluated in cell and animal models for a potential candidate for genetic therapeutics.

各种功能核酸不断从自然界发现或利用人工筛选方法制造出来，其巨大应用潜力尤其表现在基因调控和基因治疗方面，大大激发了关于核酸的结构-功能关系研究和功能优化。我们在本项目中提出，在功能核酸中，碱基的种类和排序具有高度保守性，每个碱基含有丰富的结构信息，各自以平面堆积和独特的功能基分布构建活性构象。以10-23 脱氧核酶为模板，以提高其催化能力和酶稳定性为目标，提出两种优化功能核酸的修饰策略：在功能结构域进行碱基的功能基水平修饰和碱基空间位置的优化。前者以设计16个核苷类似物并引入蛋白质活性的功能基，后者以3个碱基的异核苷对映体（6个）引入。异核苷在此脱氧核酶的催化结构域和识别臂的引入，还将起到提高其抗酶解稳定性的作用。在分子水平评价的基础上，筛选高效脱氧核酶的结构；通过参与催化反应的各个影响因素的评价和分子动力学模拟探讨其催化机制和构象；并开展细胞和动物水平的初步评价，筛选用于基因治疗的候选药

10-23脱氧核酶是人工筛选出来的DNA催化剂，是一个极具潜力的基因治疗药物。但它的二价金属离子依赖性和体内的低浓度限制了它的反应速率。本研究的目的是为了提高其催化反应速率，降低对于二价离子的依赖性。针对数量最多的碱基单元，5个腺嘌呤（A5，A9，A11，A12，A15）和催化位点的A0进行了深入的功能基分析，每个腺嘌呤的6-氨基都是非常重要的功能基。但进一步引入功能基，在A9位上获得了有利于催化反应的效果。比较氨基，咪唑基，胍基，以及连接臂对于催化反应的影响，反应速率提高5-7倍。尤其值得注意的是，A9是一个独特的位点，在它的6-氨基和8-氮-7-去氮-腺嘌呤的7-位引入功能基，都带来催化能力的提高。通过引入异核苷和翻转的胸苷单元(以3’-3’和5’-5’-磷酸二酯键连接)，除了T8，各个碱基的空间位置也具有高度保守性。.对修饰脱氧核酶进行了初步的机制研究，其pH-依赖性、金属离子选择性、对于底物剪切位点的选择性和10-23脱氧核酶相同。对于不同的底物，其催化性能保持不变。因此，修饰脱氧核酶的活性变化是内在的性质。对于修饰脱氧核酶的催化结构域进行了分子动力学模拟表明，修饰单元的引入，引起了局部结构的变化，以及金属离子位置的变化，这可能是影响催化能力的原因。.在修饰脱氧核酶的识别臂两端分别引入硫代磷酸骨架，和在3’-端附加翻转的脱氧胸苷单元，都对活性没有影响。而且，使脱氧核酶的抗酶解稳定性大大提高，说明运用催化结构域和识别臂的组合修饰有利于脱氧核酶的成药性。.在本研究的基础上，我们提出基于功能基水平的功能核酸优化策略，初步的应用获得预期的功能优化结果。将本研究的腺嘌呤和胸腺嘧啶的功能基修饰应用于8-17和17E脱氧核酶，不但提高了催化反应速率，还扩大了对于Ca2+和Mg2+依赖性的差异（大于50倍），为基于脱氧核酶的生物传感器设计提供了更好的关键元件。针对凝血酶适配体的结构修饰，延长了抗凝血时间。因此，在目前对于天然和筛选的功能核酸热点研究领域，我们提出的功能核酸优化策略是可行的。