基于化学修饰的高效10-23脱氧核酶类似物的发现

10-23脱氧核酶是一个具有专一性催化裂解底物RNA的DNA分子，被广泛研究作为抗肿瘤、抗病毒等的基因治疗候选药物。但它的不足之处是细胞内的Mg2+浓度不足以发挥它的快速裂解mRNA的能力，而目前对于10-23脱氧核酶的化学修饰未能提高其催化效率。我们着眼于它的催化结构域的9个嘌呤碱基的五员环部分，即9个7位氮原子与其它功能基之间的相互作用可能对反应发生重要的影响，提出从微小的扰动到功能基引入的逐步化学修饰策略，利用多种核苷类似物研究9个7-位氮原子对于脱氧核酶的重要性，它在五员环的位置变化和羟基、氨基、咪唑基等的引入等对脱氧核酶催化速率的影响，发现能提高催化效率的化学修饰方式，包括在催化结构域中的修饰位点的选择和用于修饰的核苷类似物两个方面。我们的前期工作表明了这一策略的可行性，预期将获得催化速率高10倍以上的10-23脱氧核酶类似物，降低对Mg2+的依赖性，获得作为基因治疗的候选药物。

10-23脱氧核酶是一个具有催化裂解互补底物RNA的DNA分子，它由两端的识别结构域和一个催化结构域组成。识别结构域以专一性碱基配对的方式识别底物，由催化结构域实现对底物的剪切，因此，它具有作为基因治疗药物和基因分析工具的巨大潜力。由于催化结构域构象未知，随机修饰成为唯一的途径，但少有提高活性的报道。我们推测在催化结构域的15个碱基都以功能基成氢键的方式，以环平面作为支撑骨架结构，构成催化活性构象，因此，我们的修饰策略是基于功能基水平的修饰。9个嘌呤碱基有一个共同的结构因素是7-氮原子，以此为出发点，在9个嘌呤位点分别实施单个功能基突变，从7-位氮原子的消除到该氮原子转移到8-位，再进一步在7位引入多种蛋白质活性功能基，实现从结构微扰到功能基引入，获得提高催化反应速率的途径。以8-氮-7-去氮-2’-脱氧嘌呤苷引入的7-位取代基的性质和对于催化活性的影响来看，在A9，G2，G14位都提高了脱氧核酶的催化速率，而且，成氢键能力强和空间占据大的功能基，对于催化构象的优化能力更大，在A9位：氨基 > 羟基 > 叔丁基苯基 > 苯基 > 氢原子，咪唑基 > 苯基；在G2和G14位，氨基 > 羟基 > 戊基 ≈ 氢原子。其中，7-胺丙基-7-去氮-8-氮-2’-脱氧腺苷在A9位的取代（脱氧核酶DZ21）获得了9倍催化速率的提高，催化效率也得到了提高；获得了针对腺嘌呤和鸟嘌呤修饰的两个先导化合物和脱氧核酶的两个先导结构。如此明确的构效关系也说明，10-23脱氧核酶的催化结构域在二价金属离子如Mg2+的帮助下，形成了一个相对刚性的催化构象。.利用pH，金属离子的浓度和种类对于催化反应的影响，机制研究表明化学修饰并未影响脱氧核酶的催化机制。我们推测所引入的功能基以成氢键或空间拥挤的方式使催化构象得到了优化。这对于我们利用别的方法来解析结构是一个很有益的提示。.更重要的是，修饰脱氧核酶的高催化效率是其内在的性质，不随底物序列而变化。针对两种底物片段（血管内皮生长因子受体II和HIV-1的保守基因片段vpr-），以及在识别结构域的硫代修饰对于催化速率的提高没有影响。.本课题设计合成了17个核苷类似物和它们的亚磷酰胺单体，合成了62个脱氧核酶序列，完成了全部结构鉴定工作，超出课题最初设计的10个化合物和45个脱氧核酶，加强了课题研究的科学性和逻辑性。