七鳃鳗HMGB1蛋白免疫学功能及其信号转导的研究

七鳃鳗是无颌类脊椎动物，是研究生物起源与进化的"活化石"。2004年Pancer等人报道在七鳃鳗中发现一类新型可变淋巴细胞受体（VLR），这种独特的适应性免疫系统决定了免疫相关分子的重要性。我们在前期研究中发现七鳃鳗的HMG蛋白家族成员HMGB1(high mobility group box 1)，它是连接细胞核内蛋白表达、炎症反应及机体免疫之间的桥梁。但在七鳃鳗中HMGB1功能尤其免疫方面研究尚未阐明，前期工作已完成七鳃鳗HMGB1重组蛋白的表达，并制备了抗七鳃鳗HMGB1多克隆抗体，Real-time PCR检测发现脂多糖刺激的七鳃鳗类淋巴细胞中HMGB1表达量上调，验证经LPS刺激的七鳃鳗血清中HMGB1含量增加。免疫沉淀实验获得与其相互作用的分子。本课题拟进一步研究HMGB1在七鳃鳗独特免疫系统中免疫方面活性以及促炎反应的信号转导通路，明确HMGB1在无颌类脊椎动物中免疫学功能。

七鳃鳗是无颌类脊椎动物，是研究生物起源与进化的"活化石"。我们在前期研究中发现七鳃鳗的HMG蛋白家族成员HMGB1(high mobility group box 1)，它是连接细胞核内蛋白表达、炎症反应及机体免疫之间的桥梁。但在七鳃鳗中HMGB1功能尤其免疫方面研究尚未阐明，因此本课题要明确HMGB1在无颌类脊椎动物中免疫学功能以及促炎反应的信号转导通路。将七鳃鳗HMGB1基因成功构建到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc上。将重组质粒pIRES2 AcGFP1-Nuc-HMGB1转染Hela细胞和七鳃鳗类淋巴细胞，利用倒置荧光显微镜直接观察表达情况，免疫印迹法确定质粒转染后HMGB1表达量上调。通过实时定量PCR法检测经重组HMGB1真核表达质粒转染七鳃鳗类淋巴细胞后，MIF和IL-17 mRNA表达量显著上调，提示HMGB1蛋白可以调控细胞因子MIF和IL-17的表达。为了研究七鳃鳗HMGB1的生物学功能，首先检测HMGB1蛋白与DNA的结合能力，纯化的rLj-HMGB1通过与七鳃鳗GAPDH的多聚核苷酸（101 bp和12 bp）反应，采用凝胶电泳迁移实验（EMSAs）分析发现重组人HMGB1蛋白和重组七鳃鳗HMGB1都可以使DNA泳动速度减慢，并呈剂量依赖关系，并且验证rLj-HMGB1蛋白可以保护pEGFP-N1质粒DNA免遭DNaseI降解。通过ELISA实验发现，rLj-HMGB1可促进THP-1单核细胞释放TNF-α，在培养24小时后分泌的TNF-α量达到最高。之后，TNF-α水平开始下降，并在48小时降到最高值的50％。用重组人HMGB1蛋白和LPS作为阳性对照，发现也都可以诱导THP-1细胞释放TNF-α产生。为了排除大肠杆菌中内毒素导致TNF-α释放，加入了阴性对照His-标签蛋白（Lj-HBP1），发现Lj-HBP1蛋白没有导致TNF-α的释放。这些实验结果表明，rLj-HMGB1可诱导THP-1单核细胞释放炎性细胞因子。