七鳃鳗免疫蛋白LIP的基因表达调控及其对病原体防御作用的分子机制

Lamprey is the important animal model for studying the origin of the vertebrate immune system. It is still unknown that how lamprey stays alive and protects itself against pathogen attack. Our previous study revealed that lamprey could secrete a novel immune protein LIP which could bind and kill pathogen specifically. The LIP gene contains a typical lectin structure and aerolysin structure domains. LIP gene expression increases significantly after pathogen infection. In this study, we aim to clarify the function of LIP regulated by transcription factors NF-κB and the signaling molecules in the pathway, and to explore the regulation mechanisms of the defense against pathogen attack through LIP knock-out and over-expression in vitro and in vivo. We also aim to identify the target molecular of pathogen and the way of LIP against pathogen attack by using the intermolecular interaction method and electron microscopy techniques in order to reveal the molecular mechanisms of the defense against pathogen attack systemically. This study supplies novel theory for revealing LIP-mediated immune response mechanism, developing the research of the origins and evolution of vertebrate immune system, and providing new data for the germplasm preservation of rare and endangered species and aquatic animal disease prevention.

七鳃鳗是研究脊椎动物免疫起源的重要动物模型，在长期水生生活中七鳃鳗是如何免受病原体攻击而存活至今尚未阐述。前期研究发现，七鳃鳗粒细胞分泌一种新型免疫蛋白LIP，能特异性结合和杀伤病原体，LIP基因含有一个典型的凝集素结构域和aerolysin结构域，病原体感染七鳃鳗后LIP基因表达量显著增加。本研究以LIP为研究对象，明确转录因子NF-κB及信号分子对LIP基因的表达调控作用，在细胞和动物水平上对LIP基因敲除和过表达，探究LIP防御病原体感染的功能及调控机制。同时，利用分子间相互作用方法及电镜技术，研究LIP识别病原体的靶分子及杀伤方式，系统解析LIP对病原体防御作用的分子机制，为进一步揭示七鳃鳗LIP介导的免疫应答机制、丰富和发展脊椎动物免疫起源和进化研究提供新的理论，为濒危物种的种质保存以及水产动物的病害防治提供新的资料。

在漫长的进化历程中与七鳃鳗同时期的物种绝大多数都已灭绝，而现存的七鳃鳗作为“活化石”记载着脊椎动物起源的整个过程，从溯源研究人类和高等哺乳动物的遗传、进化、发育及生理特征等方面，七鳃鳗有着不可替代的作用。七鳃鳗基因组保持脊椎动物最原始的特点，对研究起源和进化有着独一无二的作用。本项目成功组装了圆口纲首个染色体级别的雷氏叉牙七鳃鳗高精度基因组，其中Lip在七鳃鳗基因组中发生了拷贝数目的显著扩增，暗示着它在七鳃鳗功能进化中发挥了重要作用。.此外，构建了鳗弧菌感染七鳃鳗的microRNA表达图谱，miR-4561靶向LIP基因并抑制LIP表达从而调节先天免疫。我们解析了LIP在2.25 Å分辨率下晶体结构，Biacore实验结果表明，LIP特异性识别并结合多天线型末端含Neu5Gc的糖链结构。我们提出LIP具有双重识别病原体的机制，LIP蛋白的N端凝集素结构域与糖基化修饰的Neu5Gc结合，C端气单胞菌溶素结构域与脂筏上的鞘磷脂结合，最终在脂筏中形成膜结合的聚合物并诱导细胞死亡。此外，将LIP基因导入受精卵，建立了斑马鱼过表达LIP的模型，通过表型特征、比较转录组测序和生理生化分析，探讨了LIP在体内的生物学功能。LIP可引起斑马鱼发育毒性，增加胚胎死亡率，表现出较强的致畸、致死和发育抑制作用。研究发现lip诱导脂质过氧化和铁死亡引起心包水肿。用特异性siRNA沉默acsl4a和tfr1a或抑制剂都可抑制铁死亡引起的心包水肿。因此，我们明确LIP可以通过调节脂质过氧化和铁死亡来参与生长发育。. 基于LIP蛋白特异性识别膀胱癌尿液中糖蛋白尿调素上含唾液酸的N型糖链这一特征，开发了尿液检测膀胱癌的LIP免疫荧光试纸产品。本产品检测时间为10 min，尿液用量40微升，检测敏感性86.84%，特异性94.44%，诊断的准确性达到80%以上。该检测产品研发成本低，具有简单、快速、微量、精准、无创的特点，可作为膀胱癌的早期筛查和术后评价的标准。本研究为脊椎动物免疫识别和免疫调控研究提供崭新的视角，并对患者的识别、临床管理和获得性治疗患者的预后分层做出重要贡献。