狂犬病病毒基因与功能关系的研究

狂犬病是一种高度致死的人兽共患病，对人类的生命安全构成了严重的威胁。本项目将运用病毒学、分子生物学、免疫学等方法和技术首先对狂犬病毒流行株进行分析，找出与当前动物用疫苗株的差异，对优势毒株进行全毒株测序，分别克隆N、P、M、L、G基因。在已建立的狂犬病毒反向遗传操作平台基础上，构建以流行毒株为骨架的N、P、M辅助质粒。以Hep-flury全长感染性克隆为基础，分别置换流行毒株的N、P、M、G、L基因，拯救含有流行毒株N、P、M、G、L基因的狂犬病毒，并对重组病毒进行致病性、免疫原性、细胞适应性、离心移行规律进行研究，定位病毒致病性、免疫原性、细胞适应性和离心移动的关健基因，筛选获得免疫原性好、致病性低、细胞中稳定繁殖的狂犬病疫苗候选株，建立狂犬病毒流行株CZTT的反向遗传操作系统。该项目的执行，对弄清我国狂犬病流行毒株的致病性、建立我国狂犬病的防控体系有着重要的科学意义和理论价值。

为了解析猪源狂犬病病毒（GD-SH01）的来源及与国内其它流行毒株的关系，我们对该病毒及全基因进行了分析。结果显示， F1、F2和F3代病毒接种乳鼠后分别于14d、9d和7d出现典型的神经症状。F4、F5代病毒接种乳鼠后5d也表现出神经症状，第7d全部死亡。F5代病毒接种于6周龄昆明成鼠，能致鼠死亡。病毒接种于细胞，第四天病毒滴度达到最高（1.0×104FFU/mL）。将GD-SH01注射于6周龄和2周龄昆明系小鼠，第一天在2周龄昆明系小鼠脑内可检测到GD-SH01的核酸，第二天在2周龄和6周龄小鼠脑内也可检测到GD-SH01株的核酸。测序结果显示，N、P、M、G、L基因核苷酸和氨基酸一致性与湖南、广西的街毒相近。.为了系统地分析基因对狂犬病病毒功能的影响，我们拯救获得了街毒单基因以及全基因替换的重组狂犬病病毒rHEP-shN、rHEP-shP、rHEP-shM、rHEP-shG、rHEP-shL和rGDSH,建立了街毒的反向遗传技术平台。结果显示, GD-SH01的N或L基因替换后， rHEP-shN、rHEP-shL的复制能力明显强于亲本HEP-Flury，而替换P基因则导致重组病毒复制能力降低。替换N、M、G、L基因的重组狂犬病病毒的致病力均强于HEP-Flury，而替换P基因的rHEP-shP毒力明显减弱。全基因和G基因替换的rGDSH、rHEP-shG与亲本野毒株GD-SH01一样，可对成鼠致死。病毒扩散实验表明,各重组病毒在BSR细胞上的扩散明显比NA细胞慢。rHEP-shM、rHEP-shL的荧光斑点形成速度明显大于HEP-Flury。对成鼠的免疫实验表明，强毒P 基因对免疫后第一周抗体的产生至关重要。免疫后第二和第三周，虽然所有病毒诱导的抗体水平均超过3.0 EU/mL，但仍以rHEP-shP和rHEP-shN为最。研究还发现，街毒GD-SH01可诱发感染细胞的自噬，并且与M蛋白关系密切，但与病毒的繁殖无直接关系。.我们利用已建立的狂犬病病毒反向遗传操作技术平台，拯救获得了M基因分别重排至2和4位的重组病毒N1M2及N1M4。结果显示，在BSR细胞2个重组病毒的复制能力比亲本毒株弱。但是在SK细胞，三者之间多步生长曲线基本一致。扩散实验显示，在极低的MOI条件下，无论在BSR细胞上还是在SK细胞，两株重组病毒的扩散能力都明显弱于亲本毒株。用荧光定量P