NIX介导多巴胺神经元线粒体经小自噬途径降解的分子机制

There should be precise control system responsible for the aberrant mitochondrial removal and repair in dopamine neurons, and it is closely related to the occurrence of Parkinson's disease. Our research revealed that microautophagy may involve in this clearance process, but its mechanism is still not clear. So, in this project, we are trying to ansower these questions: first, if NIX directly regulate the recognition between mitochondria and lysosome; second, if active oxygen species control the degradation process mediated by NIX; and at last, which adaptor protein in lysosome could be specifically connected with NIX. Here, we would choose the rotenone-treated dopamine neurons of mice as PD model, and immunofluorescence staining, immunoprecipitation, reporter genes, immune electron microscopy and siRNA would be used to determine the role of NIX. N-acetylcysteine and ebselen would be used to scavenge the reactive oxygen species generated by mitochondrial, and yeast two hybrid screening would also be adopt to screen the adaptor protein. Through these work, it might be elucidated that the process of mitophagy mediated by NIX, and it could recruit the new evidence in maintenance of mitochondrial metabolic stability and occurrence of PD. It also could expand the understanding of autophagy by people; and at the same time provide reliable theoretical basis in diagnosis and treatment of PD and other neurodegenerative diseases, and so as tumor.

多巴胺神经元内存在着精确的调控系统负责异常线粒体的清除和修复，这些调控系统与帕金森病的发生密切相关。我们的前期研究揭示小自噬途径可能参与了这一调控过程，但是其分子机制还不清楚。本项目拟采用鱼藤酮处理小鼠多巴胺神经元作为PD模型，通过免疫荧光染色、报道基因、免疫电镜技术和siRNA技术研究NIX在介导线粒体与溶酶体识别连接中的作用；使用N-乙酰半胱氨酸和依布硒清除线粒体产生的活性氧，研究活性氧对NIX介导的这一降解途径的影响；同时借助酵母双杂交技术筛选这一降解途径中与NIX特异识别的接头蛋白，并采用免疫共沉淀技术、siRNA技术等进一步确认其功能；通过上述研究，阐明NIX介导线粒体经小自噬途径降解的分子机制，探讨小自噬途径在维持线粒体代谢稳定以及调控PD发生方面的作用，不仅可以从分子水平上拓展人们对细胞自噬调控机制的认识，同时也为PD和其它神经退行性疾病乃至肿瘤的诊断治疗提供可靠的理论基础。

多巴胺神经元内存在着复杂的自噬系统负责异常线粒体的清除，这些系统与帕金森氏病（PD）的发生密切相关。小自噬途径是细胞经典自噬途径之一，其可能也参与了这一生理调控过程。本项目拟通过阐明NIX介导线粒体经小自噬途径降解的分子机制，探讨小自噬途径在维持线粒体代谢稳定以及调控PD发生中的作用。首先，我们使用不同浓度和时间的鱼藤酮处理PC12细胞，结果显示随着鱼藤酮处理浓度升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和GFP-LC3荧光斑点数量均随之增加；随着鱼藤酮处理时间延长，GFP-LC3荧光斑点数量也随之增加，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值先升高后降低，透射电镜显示细胞线粒体受损和细胞自噬水平增加。上述结果表明鱼藤酮处理能够诱导PC12细胞的线粒体损伤和自噬水平的增加。其次，我们构建了SWB-NHT-NIX慢病毒质粒，感染293T细胞后，使用不同浓度的CCCP处理感染293T细胞，结果表明过表达NIX可以提高CCCP诱导293T细胞的自噬水平，并且促进UCHL1的表达。同时，我们构建了NIX慢病毒质粒，感染PC12细胞后，使用不同浓度和时间的CCCP处理PC12细胞，实验结果表明过表达NIX可以提高PC12细胞的自噬水平，并降低线粒体膜蛋白TOM20、琥珀酸脱氢酶亚基A的表达水平，证明过表达NIX可以提高CCCP诱导PC12细胞的线粒体自噬水平。然后，我们构建了干扰LAMP-2A和TSG101表达的慢病毒载体，感染PC12细胞后，Western blot检测显示下调LAMP-2A和TSG101蛋白表达均能够抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的降解（P<0.01），并提高LC3-Ⅱ蛋白的含量（P<0.01），表明内体小自噬途径参与了细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)的降解过程。最后，我们利用 TSG101 shRNA-1慢病毒稳转PC12细胞作为抑制内体小自噬的细胞模型，使用不同浓度和时间的CCCP处理PC12细胞，实验结果表明抑制内体小自噬途径可以提高CCCP诱导PC12细胞的自噬水平，并抑制线粒体膜蛋白NIX、TOM20、琥珀酸脱氢酶亚基A的降解。我们的研究结果表明内体小自噬途径可能也参与了哺乳动物细胞线粒体的自噬过程，这一研究工作将为PD等神经退行性疾病的预防和治疗提供新的思路。