线粒体自噬途径在活性氧介导的小胶质细胞活化中的作用及调控机制

小胶质细胞活化释放的活性氧（Reactive oxygen species, ROS）参与多种慢性神经损伤的发病。目前认为，小胶质细胞中NADPH氧化酶的激活是ROS的主要来源。课题组体外实验发现，脂多糖可诱导小胶质细胞线粒体中ROS升高及线粒体自噬发生。结合已有报道，我们推测线粒体可能也是活化细胞ROS的重要来源。为此，本项目将分别选用呼吸链抑制剂、线粒体自噬诱导剂和抑制剂，改变体外培养的小胶质细胞中线粒体ROS含量，通过观察小胶质细胞形态及分泌功能变化来探讨线粒体来源的ROS是否参与小胶质细胞活化，并研究ROS的活化作用是否与MAPK/NF-кB有关；干扰Beclin 1、ATG5、Bcl-2及VDAC等线粒体自噬相关基因表达，探索线粒体自噬途径在调控线粒体ROS和细胞活化中的作用。研究结果将从线粒体-自噬-ROS角度揭示神经损伤的炎性机制，为神经退行性病变等疾病的防治提供实验依据。

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）与小胶质细胞活化介导神经元炎性损伤关系密切。线粒体是细胞内ROS的主要来源，但线粒体自稳失衡如何调控ROS生成及小胶质细胞活化尚不明确。本研究发现，线粒体呼吸链复合物抑制剂鱼藤酮、TTFA、抗霉素A、叠氮钠和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可影响体外培养的原代小鼠小胶质细胞及BV细胞活性、细胞形态（细胞变圆、突起变短变粗直至细胞折光性减弱，细胞漂起）及细胞周期，诱导细胞凋亡及线粒体内ROS生成、线粒体膜电位降低及线粒体肿胀、自噬泡形成的形态变化；促进小胶质细胞分泌TNF、IL-1、IL-12、IL-6等炎性因子；诱导小胶质细胞内p38、ERK1/2、JNK及NF-κB活化。上述效应以鱼藤酮和抗霉素A为著，且呈剂量依赖性；该促炎效应可被抗氧化剂APDC、MAPK和NF-κB通路特异性阻断剂所拮抗。自噬诱导剂雷帕霉素预处理可拮抗脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的细胞内线粒体ROS水平增高和炎性因子分泌。用LPS刺激Beclin1 siRNA和ATG5 siRNA基因敲降BV-2细胞株，发现抑制Beclin和ATG5 基因表达可抑制细胞自噬活动，促进LPS介导的小胶质细胞内线粒体ROS水平升高、膜电位下降，炎性因子分泌增加；且该效应可被MAPK和NF-κB信号通路的特异性阻断剂所拮抗。用LPS刺激VDAC基因敲降的BV-2细胞发现，VDAC1和VDAC2基因抑制细胞内线粒体ROS水平降低，炎性因子释放减少；用LPS刺激高表达Bcl-2的BV细胞发现，高表达Bcl-2细胞内VDAC表达减少，线粒体ROS水平降低，炎性因子分泌减少；表明LPS通过ROS活化小胶质细胞与线粒体自噬相关蛋白Bcl-2/VDAC有关，线粒体稳态参与小胶质细胞活化。本研究结果从线粒体稳态-自噬-ROS角度表明，阻断线粒体呼吸链或抑制细胞自噬活动均可使线粒体内ROS水平增加，经MAPK/NF-κB途径激活小胶质细胞释放炎性因子；自噬活动增强可抑制小胶质细胞内ROS生成及炎性因子释放，线粒体自噬活动可通过调控线粒体稳态控制线粒体内ROS水平影响小胶质细胞活化。研究结果从线粒体-自噬-ROS角度探索了小胶质细胞活化介导炎性损伤的调控机制，丰富了对线粒体自噬生理病理功能的认识，为神经炎性损伤的临床防治提供了新的分子靶点。