伪狂犬病病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合疫苗载体的构建及评价

RNA virus replicon-derived vectors are widely used for development of new-type DNA vaccines owing to their high safety and high-level gene expression. The vaccine efficacy, however, is undesirably low due to the large size of the DNA plasmid. How to improve the delivery efficiency of the replicon vectors is the key to enhance the efficacy of replicon vector-based vaccines. .Previously, we developed a human adenovirus/Semliki Forest virus replicon chimeric vector-based vaccine against classical swine fever that induced a surprisingly sterilizing immunity. This proposal is aimed to investigate the feasibility of pseudorabies virus (PRV)/Japanese encephalitis virus (JEV) replicon chimeric vector as a trivalent vaccine vector, in which the PRV Bartha-K61 vaccine strain is used to deliver the replicon vector derived from the JEV SA-14-14-2 vaccine strain. Firstly, we will construct a stable JEV replicon vector by introduction of a chimeric intron. Then we will generate a chimeric PRV/JEV virus, in which the JEV replicon vector harboring the green fluorescent protein (EGFP) reporter gene is recombined into the PRV genome, and evaluate its in vitro replication stability. Lastly, we will create a PRV/JEV chimeric virus expressing classical swine fever virus E2 gene as a model gene and test its safety and immunogenicity in animals. .This kind of polyvalent vaccine vector, which utilizes a DNA virus to deliver an RNA virus replicon vector, represents a major innovation and breakthrough that will possibly bring a revolution in vaccinology. This project will also found a powerful vaccine development platform with a self-owned intellectual property.

RNA病毒复制子载体因安全、表达效率高等优点，被广泛用于新型DNA疫苗研制。但因其基因组较大，导入机体效率较低。如何提高复制子载体疫苗的递送效率，是增强其效力的关键。此前我们利用腺病毒递送甲病毒复制子载体猪瘟疫苗诱导了出人意料的消除性免疫。本项目创新性地利用伪狂犬病病毒疫苗株递送基于日本脑炎疫苗株的复制子载体，探讨伪狂犬病病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体作为三价疫苗载体的可行性。首先通过引入内含子构建稳定的日本脑炎病毒复制子，再将携带绿色荧光蛋白基因的日本脑炎病毒复制子重组于伪狂犬病病毒基因组中，获得伪狂犬病病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合病毒，评价其复制稳定性，最后以猪瘟病毒E2基因为模型，通过动物实验评价嵌合载体的安全性和免疫原性。应用DNA病毒递送RNA病毒复制子载体作为多价疫苗递送系统，是疫苗学理念的一个重大突破和创新，本项目可望创建一个具有自主知识产权的强大疫苗研发平台。

RNA病毒复制子载体因安全、表达效率高等优点，被广泛用于新型DNA疫苗研制。但因其基因组较大，导入机体效率较低。如何提高复制子载体疫苗的递送效率，是增强其效力的关键。本项目创新性地利用伪狂犬病病毒（PRV）递送基于日本脑炎疫苗株的复制子载体，探讨伪狂犬病病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体作为三价疫苗载体的可行性。. 2011年以来，我国多个地区免疫过Bartha-K61株的猪场爆发了伪狂犬病。研究表明，此轮疫情是由PRV变异株引起的，现用的Bartha-K61株疫苗不能对PRV变异株提供完全保护。本课题以PRV变异株（TJ株）为基础，对其主要毒力基因gE/gI进行了缺失，构建了双基因缺失病毒rPRVTJ-delgE/gI，并对其进行了评价。证实其对仔猪及母猪是安全的，并且能对PRV TJ株的攻击提供快速、完全的保护。但是该双基因缺失病毒rPRVTJ-delgE/gI对绵羊和小鼠还具有一定致病性，为了提高rPRVTJ-delgE/gI的安全性，进一步构建了三基因缺失病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK，对其进行了系列鉴定。结果显示，rPRVTJ-delgE/gI/TK对小鼠、绵羊及猪只均安全。rPRVTJ-delgE/gI/TK接种绵羊和猪只后，能够完全抵抗致死剂量PRV TJ株的攻击。为了评价了rPRVTJ-delgE/gI/TK作为活疫苗载体的潜能，我们构建了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2，证实外源基因能够在该重组病毒中稳定存在和表达，免疫猪只后能够对CSFV和PRV的攻击提供完全的保护。以上研究结果说明rPRVTJ-delgE/gI/TK可以作为活疫苗载体来构建多价疫苗。. 随后，我们通过引入内含子构建了稳定的日本脑炎病毒复制子，并将携带EGFP基因和猪瘟E2蛋白基因的日本脑炎病毒复制子重组于伪狂犬病病毒基因组中，构建了重组病毒rPRVTJ-JEV-EGFP和rPRVTJ-JEV-E2，并对其复制稳定性进行了评价。结果证实，日本脑炎病毒复制子能够在重组伪狂犬病病毒中稳定存在，EGFP和E2基因也能够正常表达。该rPRVTJ-JEV-E2的免疫效力正在评价当中。. 应用DNA病毒递送RNA病毒复制子载体作为多价疫苗递送系统，是疫苗学理念的一个重大突破和创新，可为其他疫苗的研制提供借鉴。