伪狂犬病病毒变异株和经典株在神经轴突中逆向传导差异的分子机制

Pseudorabies virus (PRV) is the causative agent of pseudorabies. It has been demonstrated that the directional transport ability of PRV in the nervous system is related with its pathogenicity. A group of new proteins are induced following PRV infection, two of which, dynein regulator LIS1 and the vesicle transport regulator Anxa2, play key roles in the efficient retrograde axonal transport. Our recent studies showed that there was a significant difference in retrograde transport between PRV TJ (variant strain) and SC strain (classical strain). We hypothesize that the difference of retrograde axonal transport may be due to the differential expression of LIS1 and Anxa2. In this proposal, we will compare the expression difference between LIS1 and Anxa2 in axons infected with either PRV TJ strain or SC strain, and then explore the molecular mechanism of difference in retrograde axonal transport in terms of vesicle transport capacity and dynein operation rate by using RNAscope, CRISPR/Cas9, tri-chamber neuronal culture system and time-lapse microscopy. This proposal is expected to reveal the molecular mechanism of difference in retrograde axonal transport between PRV variant and classical strains and will explain the enhanced neuropathogenicity of PRV variant from the host's point of view. It will provide insights for the development of target vaccines against PRV and antivirals against human herpesviruses.

伪狂犬病病毒（PRV）是伪狂犬病的病原。研究证实，PRV在神经系统中的传导能力与其致病力相关。PRV感染后，可诱导轴突中新蛋白的合成，其中动力蛋白调节因子LIS1和囊泡运输调控因子Anxa2对PRV在神经轴突中的逆向传导起重要作用。我们前期研究显示，PRV变异株 （TJ株）和经典株（SC株）在神经轴突逆向传导中存在明显差异。我们推测，这种传导差异是由于LIS1和Anxa2表达量差异所引起。为此，本研究拟以这两种蛋白为研究对象，利用RNAscope、CRISPR/Cas9、神经细胞三室培养和时差显微成像等技术，比较TJ株和SC株感染神经轴突后 LIS1和Anxa2的表达量差异，并且从囊泡运输能力、动力蛋白运行速率等方面探究两种毒株逆向神经传导差异的分子机制。本项目有望从宿主角度阐明PRV变异株和经典株神经致病力差异的机制，为PRV新型靶向疫苗和人疱疹病毒抗病毒药物的研发提供参考。

伪狂犬病病毒（PRV）是伪狂犬病的病原。研究证实，PRV在神经系统中的传导能力与其致病力相关。前期研究显示，PRV变异株（TJ株）和经典株（SC株）感染神经组织的嗜性存在明显差异。本项目系统比较了TJ株和SC株在神经轴突中传导的差异以及感染神经轴突后LIS1和Anxa2的表达量差异；其次比较了TJ株和SC株感染神经细胞后病毒复制周期差异，并解析了引起差异的分子机制。结果显示，结果显示，PRV TJ株与PRV SC株在神经元轴突传导阶段无显著差异，两种毒株感染神经轴突后LIS1和Anxa2的表达量、囊泡运输能力、动力蛋白运行速率也无显著性差异。PRV变异株能在感染神经细胞的早期产生更多的子代病毒，但这种差异会随着感染剂量的加大和感染时间的延长而缩小。随后我们将两个毒株感染神经细胞的生命周期进行了比较，发现PRV变异株入侵神经细胞的效率显著高于经典株，这在入侵过程中的吸附和内化阶段均有体现。为了鉴定导致PRV变异株入侵神经细胞效率增强的关键病毒因子，我们将参与PRV入侵的关键变异蛋白gB、gC和gD进行了功能性评估，发现突变的gB、gC和gD蛋白均对PRV变异株的入侵能力增强起到不同程度的促进作用，同时还具有显著的协同增强作用。最终鉴定出gB、gC和gD蛋白的突变是造成PRV变异株入侵神经细胞效率增强的关键病毒因子，但gD蛋白的作用最为显著。为了进一步探究影响PRV TJ株侵入N2a细胞能力增强的关键蛋白位点，我们构建了表达不同位点突变的gD蛋白的HEK293S细胞系，并应用表面等离子共振技术对嵌合gD蛋白与其受体Nectin-1的亲和力进行了分析；同时运用体外膜融合技术分析了不同位点突变的gD蛋白对膜融合能力的影响。进一步我们构建了gD蛋白点突变的嵌合病毒，并在体外N2a细胞和体内小鼠上评价了不同嵌合病毒侵入神经细胞和感染小鼠神经组织的能力。结果显示，gD蛋白第278位R和279位P的缺失导致了gD蛋白与Nectin-1的亲和力增强，进而使PRV变异株侵入神经细胞的能力增强，但是不同的gD蛋白点突变的嵌合病毒感染小鼠后，在其神经组织中的病毒含量差异不明显。本项目为深入阐明PRV变异株致病力增强的机制提供了重要依据，也为研制新型伪狂犬病疫苗和人疱疹病毒抗病毒制剂提供重要参考。