川乌炮制、配伍的质量控制及评价方法研究

本项目在对川乌的化学物质基础及炮制配伍机理透彻研究的基础上，针对有毒中药-川乌临床使用中安全、有效、质量可控的迫切需求，以及中药指纹图谱研究中"谱效关系"的难点问题，从有毒中药-川乌炮制、配伍过程的质量控制入手，以现代质谱技术为主要研究手段，选择抗炎活性筛选的靶分子-环氧化酶-2，建立超滤-亲和选择质谱，强度衰减-亲和选择质谱分析方法，获得不同炮制品的质谱生物指纹图谱，阐明炮制机理。利用肝微粒体代谢模型，通过质谱代谢指纹图谱分析方法的建立及对比分析，对川乌-白芍、川乌-防己典型药对的减毒增效机理进行阐释。同时，以指纹图谱及活性、毒性评价指标为质量控制及评价方法，对炮制品的质量及配伍中药对川乌主要生物碱成分的代谢影响进行评价。

采用UPLC-ESI/MSn技术，结合化学计量学方法，建立了生川乌及炮制品质量的化学指纹图谱评价方法，确定了对质量影响较大的化学标志物主要为双酯型和单酯型生物碱。建立了制川乌的标准指纹图谱及同时定量川乌中6种生物碱的二维UPLC-UV-MS分析方法，大大拓宽了分析范围。综合考虑毒性和药效，以3种单酯型生物碱含量之和作为制川乌的含量测定指标，以双酯型生物碱的含量作为限量指标。首次确定毒性评价系数及评价指标。此外还建立了用于川乌炮制品快速质量评价的DART-MS指纹图谱及原位分析方法，以及MALDI-MS化学指纹图谱方法。. 利用离心超滤质谱法（UF-LC-MS）与强度衰减MALDI-FT-MS方法，从川乌提取物筛选出6种能与酸性糖蛋白（AGP）发生相互作用的生物碱，筛选出9种与人血清白蛋白相互作用的生物碱，建立了以载药蛋白为靶点的川乌生物指纹图谱。利用UF-LC-MS方法，从川乌中筛选出与抗炎靶点—环氧化酶-2（COX-2）存在相互作用的10余种生物碱成分，建立了与抗炎活性相关的川乌生物指纹图谱，首次将川乌的抗炎活性与其质量评价联系起来。建立了基于前列腺素E2衍生化的COX-2酶抑制活性质谱分析方法。证明单酯型生物碱的COX-2酶抑制活性大于双酯型生物碱。对不同炮制方法制备的制川乌体外COX-2抑制活性分别进行考察，细胞实验与分子水平测定结果一致。确定了用于评价制川乌质量的抗炎活性评价系数及评价指标。表明煮制川乌的活性远低于高压蒸制川乌。并利用动物实验对其进行验证。综合药效学和代谢组学研究结果，表明高压蒸制川乌对于佐剂型关节炎的治疗效果优于煮制川乌。. 利用UPLC-MS/MS，结合特异性抑制剂探针方法，建立了川乌生物碱组分、川乌及配伍药对的代谢指纹图谱。并利用多探针底物方法，对单酯型、双酯型生物碱及配伍药对对CYP亚型酶的抑制作用进行了研究。证明防己、白芍与川乌配伍使用，均能降低川乌对CYP3A、CYP2D、CYP2C及CYP1A的抑制。而双酯型生物碱主要经过上述亚酶代谢, 说明上述配伍均能使乌头中的有毒生物碱加速降解，起到增效减毒的作用。此外，肠内菌代谢实验表明，制川乌和白芍、防己配伍后，其代谢产物中单酯型生物碱等有效成分含量增高，具有增效作用。此外，还建立了川乌及其配伍药对的ESI-MS和MALDI-MS代谢指纹方法。