离子淌度质谱方法研究ALS疾病相关蛋白的错误折叠、聚集及靶向抑制剂

The misfolding and aggregation of proteins are closely related to many neurodegenerative conformational diseases. Among these diseases, the misfolding and aggregation of metal-deficient and oxidation-induced Cu, Zn superoxide dismutase (SOD1) plays important roles in the onset and development of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In order to explore the misfolding and aggregation mechanism of SOD1 and to clarify main influence factors on promoting the misfolding and aggregation of wild type and mutant SOD1, the project will take the advantages of ion mobility-mass spectrometry and modern analysis techniques to study the structure stability of SOD1 oxidation-induced products and the conformation of their oligomers. Based on this basis, the high-throughput screening methods by using electrospray ion mobility mass spectrometry technology will be developed for screening the protein aggregation inhibitors in natural products. The action mechanism of the inhibitors will be investigated using computer simulation method combined with multiplux electron capture dissociation-tandem mass spectrometry. And the blood-brain barrier permeability of the inhibitors will be explored using MDCK-MDR1 cell model in order to find the inhibitors with good druggability. The above studies will be very helpful to deepen the understanding of ALS disease pathogenesis, promote the research of related innovative drug, and provide new treatment strategies for ALS diseases in clinic. Meanwhile, the research results of this project would also provide the related methodology for investigating other conformational diseases and screening other small molecule inhibitors.

蛋白质的错误折叠、聚集与多种神经退行性疾病密切相关。其中，金属离子失衡及氧化损伤诱导的铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）错误折叠与聚集在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的发生、发展过程中扮演了重要角色。本项目充分发挥离子淌度质谱及现代分析手段的优势，从SOD1的错误折叠、聚集机制入手，通过对SOD1氧化损伤产物的结构稳定性及寡聚体构象的研究，阐明野生型与突变型SOD1的错误折叠及聚集机制，确定抑制聚集的靶向分子；在此基础上，建立以电喷雾-离子淌度质谱为主要手段的蛋白聚集抑制剂高通量筛选方法，并结合计算机模拟技术及电子转移裂解串联质谱方法对抑制剂的作用机制进行研究；利用细胞模型研究抑制剂的血脑屏障通透性，以期获得具有较好成药性的小分子抑制剂。上述研究将有助于深化对ALS疾病发病机理的认识，促进与之相关药物的创新研发，为ALS疾病的临床治疗提供新的策略。同时也为其它构象疾病及小分子抑制剂的研究提供方法学

由于ALS疾病的发生发展与SOD1的错误折叠、聚集密切相关，本项目以离子淌度质谱为主要手段，结合荧光光谱等手段，进行SOD1错误折叠、聚集机制及天然小分子抑制剂筛选等方面的研究。.针对金属离子失衡在SOD1错误折叠及聚集中的重要影响，采用离子淌度质谱及多种质谱技术，对野生型 SOD1（WT SOD1）、脱辅基SOD1及金属重组SOD1在不同条件下的结构和构象稳定性进行了研究，发现并鉴定了SOD1二聚体离子在气相中的分解和去折叠的三种途径；证明apo-SOD1相较于金属重组SOD1和野生型SOD1，更易发生解离及去折叠，明确了金属离子对于SOD1二聚体结构及构象稳定性的重要作用。.深入研究了氧化损伤诱导的不同类型SOD1解离、聚集过程及产物，明确了氧化损伤对不同类别SOD1结构和构象稳定性的影响，以及异黄酮类化合物的抑制作用。观察到脱辅基和重组SOD1具有二聚体和单体形式的氧化产物，而单体氧化产物还会具有额外的带电残基。其结构和构象稳定性相对于氧化前大幅降低，且氧化使其结构变得更加松散；聚集程度显著增大；大豆异黄酮苷通过抑制氧化产物的生成以及稳定氧化产物的结构，在一定程度上抑制了apo-SOD1氧化体系的聚集。.针对中药成分的复杂性，建立了由多成分、多靶点到单成分、多靶点再到单成分单靶点的SOD1结构稳定剂及聚集抑制剂的筛选方法。确定了单体和二聚体形式的脱辅基SOD1是作用最强的靶分子，而二铜重组SOD1则是次要靶分子。对黄酮、蒽醌类等天然化合物进行筛选，得到10余种能较好稳定SOD1二聚体结构、抑制其聚集的活性成分，并利用理论计算与质谱竞争实验相结合的方法，对其中代表性化合物的作用位点进行了探讨；进一步利用MDCK-MDR细胞实验，对活性成分的血脑屏障通透性进行了评价，为其成药性研究提供了科学依据。.研究结果发表论文15篇，其中SCI14篇，培养博士研究生4人。