新型生物肽CC12介导抗VEGF药物无创眼内递送抑制病理性血管新生的研究

Intravitreal injection of biological drugs, such as the widely used anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapeutics, provides a potent prevention and treatment modality for "wet" type of age-related macular degeneration. However, this is an invasive strategy that can be exacerbated with repeated injections during the long-term therapy. Therefore, it is of great practical significance to develop a novel noninvasive drug delivery system that can penetrate the ocular biological barrier and target the retina. In our previous study, in vivo-directed evolution phage display technology was employed to identify a novel dodecapeptide, named CC12, with the ability to penetrate the ocular barrier in a noninvasive (via conjunctival sac instillation) manner. And data of multilevel evaluations demonstrate the penetration capacity of CC12. Based on that, this study will further explore the potential of CC12 carrying anti-VEGF drugs as eye drops to mediate noninvasive delivery in the treatment of neovascular fundus diseases. Experiments such as ARPE-19 cellular uptake, flow cytometry quantitative analysis, apparent permeability assay and animal models will be conducted to elucidate its ability of penetration, effectiveness of noninvasive intraocular delivery and safety of intraocular application. Meanwhile, intraocular drug delivery process will be simulated by computational fluid dynamics, which could help to determine the dosing regimen. This study will provide a practical way and a scientific method for enhancing the absorption of protein drugs by noninvasive intraocular drug delivery.

新生血管性黄斑变性等致盲性眼病目前主要的治疗策略是玻璃体腔内注射抗血管内皮生长因子（VEGF）等大分子蛋白类药物。然而长期治疗过程中反复的有创注射，感染和组织损伤等难以避免。因此，研发能突破眼生物学屏障、靶向眼底、无创的药物递送系统具有重要的现实意义。我们已通过噬菌体展示技术筛选出一新型眼部引导肽CC12，并对其穿膜作用和携带多肽类药物的效果作了论证。本项目将在前期研究的基础上，进一步探索CC12携带抗VEGF药物的穿膜特性和无创滴眼治疗新生血管性眼底病变的潜能。通过人视网膜色素上皮细胞系摄取内化、流式细胞分析、离体眼组织表观渗透率和动物模型等体内外实验，揭示CC12介导蛋白类药物的跨膜能力、无创治疗的有效性及其眼内应用的安全性；并利用计算机流体力学方法模拟眼部药物递送过程，辅助给药方案设计。本研究预期的结果将为实现蛋白类药物的无创眼内递送提供科学依据，具有重要的理论和现实意义。

在我国，新生血管性黄斑变性（wet-AMD）、糖尿病性视网膜病变（DR）等新生血管性眼底病已成为主要的致盲性眼病。我们的研究工作旨在通过穿膜肽介导无创给药，从而增强多肽或蛋白类新生血管抑制剂的眼内药物递送。在穿膜肽的筛选及机制研究方面，我们通过内吞抑制和内吞示踪实验对比了CC12和Penetratin穿膜肽的穿膜机制，阐明Penetratin的主要转运路径是直接穿膜，辅以部分内吞途径穿膜，细胞内化摄取的方式主要为胞膜窖以及网格蛋白介导的胞饮；而CC12主要通过内吞途径穿膜。并明确了Penetratin介导药物进入眼内的主要方式可能以混合给药为主，通过Penetratin促发膜重排，引导其他类型药物共同跨眼屏障递送入眼。在新生血管抑制剂的研发方面，课题组筛选、开发了抑制新生血管多肽NT/K-CRY以及NTK/CRS，并通过细胞迁移、管腔形成和细胞增殖等体外实验，以及鸡胚尿囊膜（CAM）和高氧诱导小鼠视网膜病变（OIR）等动物模型，采用western blot和PCR检测OIR模型中血管内皮生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）的表达，验证了这两个新型生物肽抑制血管新生的有效性及安全性；此外，我们进一步筛选了特异性抗VEGFA的纳米抗体hu biNb24，并进行分子活性和VEGF阻断活性鉴定。同时，课题组创新性地将穿膜肽Penetratin与筛选获得的特异性抗VEGFA纳米抗体混合制备滴眼液，通过猴激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型，验证了上述滴眼液通过无创给药抑制眼底病理性血管新生的潜能。通过与上海交通大学船舶海洋与工程学院合作，运用计算机流体力学方法建立眼部药物递送的仿真数值模型。此外，我们进一步研究发现EFEMP1过表达可促进wet-AMD新生血管形成，EFEMP1有望成为新生血管性眼底病变的生物标志物和治疗靶点。